芹菜素对慢传输型便秘小鼠的通便作用

苏立杰，李国坤，陈淼焕，曾钰鹏，韦艳祝，陈骁熠，陈静

（1.广州医科大学公共卫生学院，广东广州 511436）（2.广州医科大学基础医学院，广东广州 511436）

慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是一种临床上常见的功能性便秘，以结肠动力减弱、结肠传输时间延长为主要特点，主要症状为便意消失、排便次数减少、粪便干硬、排便费力，其症状顽固，严重者可诱发心脑血管疾病、结直肠癌等并发症，严重影响患者的生活质量和心理健康[1,2]。据相关报道，慢性传输型便秘全球发病率约为14%，其中我国发病率为3.19%～11.6%，且呈上升递增趋势[3]。已有的研究表明，STC发病因素众多，其可能与胃肠动力不足、激素水平紊乱、肠道菌群失调[4]、Cajal间质细胞变化[5]、肠神经异常[6-8]、结肠粘膜水通道改变[9,10]等有关。STC现有的治疗方法主要有药物治疗（缓泻剂和促动力剂）、手术和粪便移植等，常规的药物治疗虽然短期内疗效较好，但长期使用会引起药物依赖、惰性结肠等不良反应，而手术和粪便移植在临床上难以普遍开展，手术治疗的复发率也较高[11,12]。因此，寻找安全有效的天然活性物质在治疗和缓解慢传输型便秘具有重要的意义。

研究显示，慢性便秘的发生与肠道菌群失调密切相关。便秘型肠易激综合征患者粪便中的双歧杆菌丰度水平较低[13]。Khalif等[14]研究发现成年功能性便秘的患者粪便中双歧杆菌菌属和乳杆菌属细菌菌落数量显著减少。张旭等[15]发现老年便秘患者粪便中肠道菌群的双歧杆菌含量显著降低。黄小明等[16]认为肠道微生物可能通过改变宿主代谢和代谢产物（包括气体、短链脂肪酸和胆汁酸）而影响肠道蠕动，进而导致慢性便秘。因此，以肠道菌群为靶点干预STC是切实可行的。

芹菜素（apigenin）是天然存在的一种黄酮类化合物，已知其具有抗肿瘤、抗炎、抗疲劳、抗动脉硬化、抗氧化、抗痛风、降压、降糖、免疫调节等多种作用[17-22]。王丽等[23]发现芹菜素能降低糖尿病小鼠血糖，并通过提高MLCK蛋白表达来改善肠动力障碍。Thaiss等[24]发现芹菜素可调节肠道菌群，进而影响减肥后的体重恢复速率。常佩亮等[25]发现肠道菌群会影响芹菜素的代谢。Hanske等[26]研究发现人体肠道微生物群对芹菜素-7-葡萄糖苷（A7G）生物利用及代谢有很大贡献。结合已有的研究报道，芹菜素与肠动力以及肠道菌群密切相关，我们推测其可能通过调节肠道菌群进而发挥改善慢传输型便秘的作用。

但目前关于芹菜素对便秘及肠道菌群的研究报导较少，故本课题拟基于STC小鼠模型，探讨芹菜素对STC小鼠的通便效果及其对肠道菌群的调节作用，为STC防治及相关功能食品的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芹菜素（HPLC≥98%），上海金穗生物科技有限公司；盐酸洛哌丁胺胶囊，西安杨森制药有限公司；碳粉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿拉伯胶，上海麦克林生化科技有限公司；吐温80，天津市福晨化学试剂厂；氯化钠，天津市大茂化学试剂厂；戊巴比妥钠（1%），天津市大茂化学试剂厂；伊红美蓝琼脂培养基，广州环凯微生物科技有限公司；胆汁七叶苷琼脂，广州环凯微生物科技有限公司；双歧杆菌琼脂培养基，广州环凯微生物科技有限公司；LBS琼脂，广州环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-250B微机生化培养箱，上海悦丰仪器仪表有限公司；移液枪，艾本德中国有限公司；玻璃仪器气流烘干器，巩义市予华仪器有限责任公司；旋涡混合仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；FE20 pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T6773电子天平，普利赛斯科学仪器有限公司（瑞士）；ZHJH-C1106B超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；MULTISKAN GO全自动酶标仪，广东丹利科技有限公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌机，日本三洋；纯水机，南京贝登医疗股份有限公司；DZF-6050真空干燥，上海-恒科学仪器有限公司。

1.3 实验动物

BALB/c小鼠，SPF级，30只，雄性，四周龄，健康状况良好，购买于广东省医学实验动物中心，合格证号：NO. 44007200049595，许可证号：SCXK(粤) 2013-0002。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠的灌胃

30只BALB/c小鼠随机分为三组：空白组（K组）、模型组（M组）和芹菜素干预组（G组）。根据各组小鼠体重按量给药，其中模型组和干预组给予10 mg/kg·BW的盐酸洛哌丁胺溶液，另外干预组再同时给予200 mg/kg·BW的芹菜素溶液，空白组和模型组再给予相应的生理盐水。灌胃14 d后观察黑便判断其造模和干预效果。其中，根据相关文献报道选择200 mg/kg·BW芹菜素剂量进行干预[27]。

1.4.2 黑便实验

连续灌胃14 d后，将各组小鼠禁食不禁水12～16 h，再进行黑便观察实验。模型组和干预组小鼠使用洛哌丁胺灌胃，空白组小鼠相应的生理盐水进行灌胃。30 min后，模型组和空白组使用生理盐水和0.2 mL墨汁灌胃，芹菜素干预组使用200 mg/kg芹菜素和0.2 mL墨汁灌胃，分别放入准备好的小隔间，进行黑便观察实验。通过对黑便粒数、墨汁灌胃时间和首颗黑便排出的时间的记录，统计出首颗黑便时间和黑便粒数。

1.4.3 粪便含水率的测定

使用隔板将老鼠隔离开，用镊子收集小鼠粪便于灭菌过的2 mL EP管中，做好标记。使用分析天平称量新鲜粪便重量，置于37 ℃的烘箱中，在24 h、48 h后称量烘干后的粪便重量，通过计算，得出粪便的含水量。

1.4.4 墨汁推进率的测量

重复1.4.1灌胃操作25 min后，立即使用腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠（1%），待麻醉后，摘眼球取血，处死，开腹取小肠测量小肠长度和墨汁推进长度，计算得出小鼠墨汁推进率。计算公式如下：

1.4.5 新鲜粪便的采集及处理

1.4.5.1 粪便采集

对小鼠肛门附近进行充分消毒后，使用无菌棉棒轻微擦拭小鼠肛门，刺激小鼠排便，并收集粪便于已知质量（b）的2 mL EP管中，盖紧备用。称量带有小鼠粪便的EP管，质量为a，计算得小鼠粪便重量为m，单位为g，其计算公式如下：

1.4.5.2 粪便稀释液的制备

对手部充分消毒后，在超净工作台上，使用移液枪向装有粪便的EP管中加入99倍粪便重量的生理盐水，搅拌捣碎，待充分混合后，再吸取1 mL粪便混合液于10 mL的无菌试管中，加入9 mL无菌生理盐水，制成浓度为10-3的粪便稀释液。重复以上方法分别制备浓度为10-4、10-5、10-6的粪便稀释液，做好标记后备用。

1.4.6 肠道细菌的体外培养鉴定与计数

1.4.6.1 培养基的配制

伊红美蓝琼脂培养基（EMB）：称取37.5 g培养基配方粉末，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，120 ℃高压灭菌15 min，冷至50 ℃倾注灭菌培养皿。

胆汁七叶苷琼脂培养基（BEA）：称取44.5 g培养基配方粉末，加入1 L蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，120 ℃高压灭菌15 min，备用。

双歧杆菌琼脂培养基（BBL）：称取59.3 g培养基配方粉末，加入蒸馏水或去离子水600 mL和西红柿浸出液400 mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，120 ℃高压灭菌15 min。（西红柿浸出液制备：将新鲜西红柿洗净后称量切碎，加入等量的蒸馏水在100 ℃水浴中加热，搅拌90 min，然后用纱布过滤，校正pH至7.0）

乳杆菌选择性培养基（LBS）：称取84.0 g培养基配方粉末，再吸取1 mL吐温80和冰乙酸1.3 mL，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，120 ℃高压灭菌15 min。

1.4.6.2 生化鉴定

触酶试验：取洁净玻片1片，用接种环挑取细菌，加入3%过氧化氢1滴，立即观察结果。若立即出现大量气泡则为阳性，否则为阴性。

氧化酶试验：直接往待测菌菌落上滴加1%盐酸四甲基对苯二胺。若细菌在与试剂接触10 s内呈深紫色，为阳性。

硝酸盐还原试验：将待测菌接种于硝酸盐培养基中，于35 ℃培养1～4 d，将甲、乙液等量混合后（约0.1 mL）加入培养基中，立即观察结果。若培养基出现红色则为阳性，否则为阴性（或假阴性）。

高盐耐受试验：将待测菌接种于6.5%氯化钠葡萄糖琼脂培养基的平板中，使用涂布棒涂匀，后置于37 ℃恒温箱内培养。24～48 h后，观察平板上是否有细菌生长。

45 ℃生长试验：将待测菌接种至肠球菌选择培养基中，使用涂布棒涂布均匀，后置于45 ℃下恒温箱内培养。24～48 h后，观察平板上是否有细菌生长。

氧气生长试验：将待测菌接种至双歧杆菌选择培养基中，用涂布棒涂布均匀，后置于37 ℃恒温箱内培养。24～48 h后，观察平板是否有细菌生长。

1.4.6.3 菌落计数（肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌）

分别取以上一系列浓度（10-3、10-4、10-5、10-6）的粪便稀释液100 μL于四种不同培养基中，均匀涂布后，置于37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h（双歧杆菌、乳杆菌的培养需使用厌氧培养袋）。每种菌种做三个平行，选取菌落总数在30～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板进行计数菌落总数取平均数。

1.5 数据处理与统计分析

所有数据均独立平行测定，数据结果以平均值±标准差的形式表示，采用SPSS 24.0软件对试验数据进行统计学分析，通过独立样本t检验和单因素方差检验做显著性分析，p＜0.05为有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 小鼠STC模型的建立

将空白组与模型组的排便指标进行对比，如表1和图1所示，可得模型组的首粒黑便时间（188.70 min）相对于空白组（74.60 min）增加了1.53倍（p＜0.05）；6 h排便粒数（10.40 n）相对于空白组（18.80 n）减少了45%（p＜0.05）；粪便重量（0.42 g）相对于空白组（0.91 g）减少了53.85%（p＜0.05）；墨汁推进率43.99%相对于空白组（78.63%）减少了44.05%（p＜0.05）。判断慢性传输型便秘小鼠模型建立成功与否的标准包括首粒黑便时间、6 h排便粒数、粪便重量、墨汁推进率。通过观察，小鼠6 h排便粒数和粪便重量任一结果阳性，并且首粒黑便时间和墨汁推进率任一结果阳性，即可判定STC模型成功建立[28,29]。根据实验结果，首粒黑便时间、6 h排便粒数、粪便重量、墨汁推进率均呈阳性，可说明小鼠STC模型建立成功。本实验使用10 mg/kg·BW的盐酸洛哌丁胺溶液灌胃14 d可成功建立小鼠STC模型，与相关文献的STC模型研究建立方法一致[30-32]。

表1 洛哌丁胺对小鼠排便指标的影响 Table 1 Effect of loperamide on defecation indexes of mice

2.2 芹菜素对小鼠首次黑便时间、6 h排便粒数、粪便重量、墨汁推进率的影响

将干预组与模型组的排便指标进行对比，如表2和图1所示，得干预组的首粒黑便时间（141.80 min）相对于模型组（188.70 min）减少了24.85%（p＜0.05）；6 h排便粒数（19.30 n）相对于模型组（10.40 n）增加了0.86倍（p＜0.05）；粪便重量（0.93 g）相对于模型组（0.42 g）增加了1.21倍（p＜0.05）；墨汁推进率（90.61%）相对于模型组（43.99%）增加了1.05倍（p＜0.05）。根据保健食品的通便功能检验方法：6 h排便粒数和粪便重量任一项结果显著，同时墨汁推进率和首粒黑便时间任一项结果显著，可判定该受试样品对便秘小鼠具有通便功效[33]，而在本次实验中，首粒黑便时间、6 h排便粒数、粪便重量、墨汁推进率均呈阳性，可判定200 mg/kg·BW芹菜素对STC小鼠具有显著的通便作用。

表2 芹菜素对小鼠排便指标的影响 Table 2 Effect of apigenin on defecation indexes of mice

2.3 芹菜素对STC小鼠粪便含水率的影响

将空白组和干预组的粪便含水率与模型组进行对比，如表3所示，可得模型组的粪便含水率（39.45%）相较于空白组（62.37%）减少了36.75%（p＜0.05），干预组的粪便含水率（72.15%）相较于模型组（39.45%）增加了0.82倍（p＜0.05）。可得出洛哌丁胺在建立小鼠STC模型可显著地降低粪便含水率，而芹菜素可增加STC小鼠的粪便含水率。

表3 芹菜素对小鼠粪便含水率的影响 Table 3 Influence of apigenin on various defecation indexes in mice

上述结果表明芹菜素具有润肠通便作用。相关研究报道发现一些富含黄酮类物质成分的天然产物也有通便的效果。付山等[34]通过检测便秘小鼠的小肠推进率，发现桑葚果汁具有通便作用，并证明其通便作用与总黄酮类成分有关；研究发现[35]沙葱中的黄酮类物质成分对洛哌丁胺诱导的便秘有通便作用，可以通过影响肠动力和肠道水分转运来达到通便的效果。因此，同属于黄酮化合物的芹菜素，也可能通过影响肠道蠕动和水分转运来发挥通便作用。

2.4 芹菜素对STC小鼠肠道菌群的调节作用

2.4.1 试验菌生化鉴定

取各组小鼠粪便，用生理盐水稀释后，分别接种在EMB、BEA、BBL、LBS培养基上，放37 ℃恒温箱培养24～48 h，通过对所培养的试验菌进行生化鉴定，确保菌群为研究所需的试验菌，其菌落形态和生化鉴定结果如表4和图2所示，肠杆菌、肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌菌落形态的生化鉴定结果均符合《伯杰氏系统细菌学手册》第九版的相关规定，可用作以下小鼠肠道细菌菌落总数计数使用。

表4 试验菌菌落形态和生化鉴定结果 Table 4 Colony morphology and biochemical identification results of the test bacteria

2.4.2 菌落计数

如表5所示，模型组的肠杆菌菌落总数（7.1×106）显著多于空白组（2.6×106），而干预组的菌落总数（2.9×106）相对于模型组显著降低（p＜0.05）。模型组的肠球菌菌落总数（5.4×106）相对于空白组（1.2×106）显著增加，而干预组的菌落总数（1.9×106）（p＜0.05）有显著下降。模型组的双歧杆菌菌落总数（2.4×107）显著少于空白组（6.9×107），而干预组（4.6×107）则显著增加双歧杆菌菌落总数（p＜0.05）。模型组的乳酸杆菌菌落总数（2.1×107）显著少于空白组（8.4×107），而干预组可显著增加乳酸杆菌菌落总数（6.7×107）（p＜0.05）。上述结果表明STC小鼠粪便有害菌肠杆菌、肠球菌显著增加，芹菜素的干预可有效地抑制肠杆菌、肠球菌的过度生长；另一方面，STC小鼠粪便中有益菌双歧杆菌、乳酸杆菌显著减少，芹菜素干预可有效地扶植双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖。

表5 芹菜素对肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌的影响(CFU/g) Table 5 Effects of apigenin on Enterobacterium, Enterococcus, Bifidobacterium and Lactobacillus (CFU/g)

根据相关文献报道，可以选择益生菌中的双歧杆菌和乳杆菌，及有害菌中的肠杆菌和肠球菌为试验菌进行体外培养，来评价对肠道菌群的影响。如李根林等[36]通过对STC模型老鼠新鲜粪便中的肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌进行培养和计数，研究复方地芬诺酯建立的STC模型老鼠中肠道菌群的变化情况。彭禛菲等[37]通过对肠杆菌、肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌进行培养和计数，发现野山杏果肉不溶性膳食纤维具有改善小鼠肠道菌群和通便的作用。因此，本课题选取双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌作为试验菌对象来评价芹菜素对肠道微生物的调节作用。本研究结果发现芹菜素干预可有效地抑制肠杆菌、肠球菌的过度生长，以及有效地扶植双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖。相关研究报道也发现类似结果。如魏涛等[38]以复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型，连续给予低聚木糖干预14 d后，低、高剂量组小鼠粪便内乳杆菌、双歧杆菌均显著增加，从而证明了低聚木糖具有改善小鼠肠道菌群及润肠通便的功能。唐飞等[39]发现适度的青砖茶可以抑制肠杆菌、肠球菌繁殖，扶植双歧杆菌和乳杆菌，从而改善小鼠肠道功能。肠球菌是一种条件性致病菌，可导致院内感染和抗生素耐药。研究报道通过体外模拟人升结肠的粪便接种物培养，发现芹菜素有效地抑制了肠球菌的生长，并影响肠球菌中涉及DNA修复、应激反应等基因的表达[40]。双歧杆菌和乳杆菌是常见的益生菌。研究报道富含双歧杆菌和乳杆菌的酸奶可以抑制洛哌丁胺诱导的便秘[41]。双歧杆菌可增加肠动力，可能与其促进短链脂肪酸（SCFAs）的产生相关[42]。研究报道给予便秘小鼠乳杆菌处理，可增加粪便含水量从而达到通便效果[43]。因此，推测芹菜素的通便作用可能与促进双歧杆菌和乳杆菌的生长，从而增加肠动力和粪便含水量相关。当然，本研究仅能表明芹菜素对四种试验菌的调节作用，还应用16s rRNA测序等技术对便秘小鼠肠道菌群中的其他微生物种群、丰度进行分析，进一步探究芹菜素调节肠道菌群改善便秘的作用机制。

3 结论

芹菜素可通过减少首粒黑便时间，增加排便粒数和重量，促进肠蠕动和增加粪便含水量，对慢传输型便秘小鼠起到通便的作用。芹菜素可能通过抑制有害菌肠球菌和肠杆菌的过度生长，以及扶植有益菌双歧杆菌和乳杆菌的生长，改善肠道微生态环境，增加肠动力和粪便含水量，从而达到通便的效果。