嘌呤能受体对骨组织代谢及功能影响的研究进展

胡雅婷，朱天啸，徐新月*

（1. 空军军医大学基础医学院学员六大队，陕西 西安 710032；2.空军军医大学第三附属医院牙周病科，陕西 西安 710032）

腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）是由腺嘌呤、核糖和三个磷酸基团连接而成的高能化合物，最初被认为是细胞中通用的直接供能物质，为各种生命活动提供能量。1972 年，Burnstock［1］首次提出ATP 也可作为一种细胞外非肾上腺素能、非胆碱能的神经递质，在胃肠道平滑肌运动中发挥调控作用。随着研究的深入，人们逐渐发现，嘌呤核苷酸可以作为一种信号分子，参与血管系统、免疫系统、神经系统以及骨组织等多种系统生命活动过程［2］。本文将针对多种嘌呤能受体的结构及功能进行总结，着重探究嘌呤能受体对于多种骨组织代谢相关疾病的影响，以期为后续针对嘌呤能受体功能调节研究提供理论依据。

1 嘌呤能受体的结构与分类

嘌呤类物质除ATP 外，还包括二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）以及其他一些磷酸腺苷类物质，接受嘌呤类物质调控的受体统称为嘌呤能受体，根据分子结构与信号转导机制的不同，嘌呤能受体可以分为两大类：P2X 家族受体和P2Y 家族受体。其中，P2X 为配体门控离子通道类型，P2Y 为G 蛋白耦联受体。目前，已发现7 种P2X 家族受体和八种P2Y 家族受体，分别命名为P2X1～P2X7 及P2Y1、2、4、6、11～14［3］。P2X 受体的氨基酸序列长度379～595，拥有2 个跨膜结构域、1 个胞外配体结合环，N 端和C端在胞内［4］。C末端的氨基酸序列长度不等提示亚单位可能存在特异性。P2X受体家族为离子通道型受体，激活后能够非选择性地透过阳离子，如Na+、K+和Ca2+［4-5］。P2Y 家族受体家族属于G蛋白耦联受体，其结构具有一些共有特征：氨基端位于胞外，羧基端位于胞内，有7 个跨膜基序。P2Y受体对于底物的敏感度从高到低依次是ATP、ADP、AMP和腺苷［6-7］。

不同的嘌呤能受体在组织中分布不尽相同，并且发挥着不同的调控作用。如P2X1 受体可以在血小板和嗜中性粒细胞中表达，并参与调节血小板活化和血栓形成［8-9］。而在哮喘患者体内，激活的P2X1受体由于细胞外ATP 增多而脱敏，导致嗜酸性粒细胞αMβ2 整联蛋白依赖性黏附下降［10］。P2X2 受体在内耳中表达丰富，可参与听力调节，此外还能参与调节激素释放过程，如促黄体生成素以及影响交感神经活动［2］。P2X3 在初级传入神经元中表达量较高，背根节处高表达的P2X3受体是炎性痛的主要参与分子之一［11］，而在颈动脉体处表达的P2X3受体可作为控制高血压的潜在治疗靶标［12］。P2X4 受体敏感性较高，广泛分布于中枢和外周神经元。在神经损伤后，敲除P2X4 基因的小鼠不表现疼痛行为［13］。此外，P2X4受体通过影响溶酶体以调节破骨细胞功能［14］。在一项结扎诱导的牙周炎小鼠模型研究［15-16］中，P2X5 受体的缺失能使小鼠牙槽骨损失减少44%，牙龈组织中促炎因子的表达随之降低。Gong等［17］在体外多肾细胞癌细胞及体内小鼠模型的临床前研究中发现，ATP激活导致的P2X6受体激活介导的Ca2+离子内流过程与癌细胞的迁徙、侵袭相关，并且其表达与肾癌的病理学分期、病理学分级及患者预后密切相关。P2X7受体是目前研究最多、功能作用机制最清楚的一种P2X 受体，能够在几乎所有的免疫细胞中表达，可以介导NLRP3 炎症小体激活，细胞因子和趋化因子的释放［18］。在最近的研究［19］中发现此受体与骨代谢密切相关，P2X7受体功能丧失时可能导致某些骨疾病或者关节疾病发生。

截至目前，已经被鉴定的P2Y 受体有P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11-14。分布在血管系统中的P2Y 受体参与血管生长以及张力的调节，同时也能激活血栓的形成过程［6］。分布于胰岛中的P2Y1和P2Y6两种受体能够刺激胰岛素分泌，而P2Y13受体的激活则起到抑制作用［20］。P2Y2受体被激活后，通过ERK1/2通路促进骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）的成骨分化，同时抑制细胞的成脂分化［21］。P2Y11受体也会对炎症环境中的心脏代谢性疾病起到一定的调控作用［22］。此外，P2Y11对于免疫系统中不同的免疫细胞有着不同的调控作用［23-25］，其在调控人类的CD8+T淋巴细胞死亡过程中发挥与P2X7 类似的驱动细胞死亡作用［26］。但迄今为止，由于检测方法、敲低方法等因素的限制，针对P2Y11受体的研究仍需进一步深入探索［27］。

以上结果反映出嘌呤能受体结构的多样性与复杂性，也反映出目前研究者对于嘌呤能受体的认识存在很多局限，因此，针对嘌呤能受体的研究仍需进一步深入。

2 骨组织与嘌呤能受体

骨组织是一种由细胞、基质和纤维等成分构成的硬组织。骨组织中包含成骨细胞、破骨细胞、骨细胞以及一些前体细胞，这些细胞成分与骨基质的相互作用，共同调控着骨组织代谢的稳态［28］。而研究［19］发现，多种嘌呤能受体可在成骨、破骨以及多种前体细胞表面表达，此外，P2 受体还能广泛表达于原代成骨细胞及成骨细胞系中（表1）［29-30］。而骨组织及其周围的肌肉细胞在受到挤压、拉伸等力学刺激后，往往会从细胞中释放一些ATP 物质，这些ATP 足以激活细胞表面的嘌呤能受体，这提示嘌呤能受体对骨组织代谢发挥着重要的调控作用。目前为止，虽已证实嘌呤能受体在骨代谢中发挥着重要的调控作用，但是尚缺乏系统研究来阐明P2X 及P2Y家族成员在不同骨细胞中的作用。

表1 骨组织中P2X受体的表达

2.1 嘌呤能受体对成骨细胞的影响

几乎所有P2X 受体都在成骨细胞表达［31］。在张力诱导下或受到创伤时，成骨细胞向胞外释放ATP，再作用于P2X7 受体将其激活，成骨细胞开始分化，伴有基质形成和矿化增加［32］；同时Runx2 等转录因子被激活，进一步达到激活成骨过程［33］。

但也有研究［34］指出，P2X7 在成骨过程中发挥着抑制作用。研究［34］指出在小鼠颅骨的成骨细胞MC3T3-E1 中，P2X7 受体、P2Y2 受体相对于P2X1受体高表达。而施加压缩力能刺激ATP 在成骨细胞的释放，使P2X7 受体和P2Y2 受体表达水平显著升高，抑制骨形成。当转染了P2X7 受体和P2Y2 受体的siRNA 后，其对于成骨细胞分化的抑制作用被解除［34］。成骨细胞对于张力及压缩力的不同反应，提示ATP 反应及嘌呤能受体在成骨细胞代谢中的复杂作用，这可能与不同细胞响应嘌呤能受体的机制不同相关，后续仍需进一步研究。

在体外，P2Y2R 过表达的大鼠原代成骨细胞在第7天矿化骨结节形成减少，ALP 活性降低，但胶原生成没有显著差异［35］。与体外结果矛盾的是，P2Y2受体基因过表达SD 大鼠股骨颈的骨强度更高，矿物附着率和皮质内样骨层厚度均较高，与野生型大鼠相比，P2Y2受体基因过表达大鼠的股骨长度会增加［35］。这表明P2Y2R 可能在骨形成过程中与多种细胞发挥相互作用，而不单单仅影响成骨细胞和破骨细胞。

此外，还有研究［36］发现，P2Y13 的敲除会导致成骨细胞和破骨细胞数量明显降低，骨组织改建速度降低50%以上。这种整体骨代谢水平的降低可以在某些情况，如雌激素缺乏诱导的骨质疏松症模型中，降低骨质流失速率，发挥一定的保护作用［36］。但在正常情况下，这种骨代谢速率的降低会导致小鼠体内整体骨小梁质量明显降低。

总之，成骨细胞对于机械力的反应多依赖于ATP 介导的嘌呤能受体激活，但目前仍缺乏成骨细胞对于不同机械力激活不同ATP 反应现象的了解，此方面值得进一步深入研究。

2.2 嘌呤能受体对破骨细胞的影响

破骨细胞同样也受到嘌呤能受体的调控。Kim等［37］研究发现，P2X5 受体主要控制破骨细胞成熟，P2X5 受体缺失尽管在小鼠体内稳态条件下不会影响正常的骨组织表型，但会导致体外破骨细胞成熟受损。进一步通过基因敲除发现，蛋白质精氨酸甲基转移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）的关键辅助因子甲基体蛋白50（methylosome protein 50，MEP50）是P2X5 受体的结合分子。MEP50 通过与P2X5 受体的C 段结合，将外界的激活信号传递至破骨细胞，并影响破骨细胞的成熟［37］。P2X5 受体C 端突变破坏这一结合会导致骨细胞成熟受损。

当细胞外ATP 激活P2Y1 受体后，破骨细胞活化中心RANKL 表达上调［38］。在破骨细胞的形成过程中，P2Y14 受体被RANKL 选择性诱导表达。经RANKL 刺激破骨细胞前体后，P2Y14受体蛋白表达水平升高。若施以RNA 干扰使P2Y14受体缺失，破骨细胞形成出现障碍。此外，P2Y 家族的其他受体如P2Y6、P2Y2、P2Y13、P2Y14 等受体同样参与破骨细胞的吸收、生存等功能活动［39］。如P2Y13 的敲除会导致破骨细胞数量明显降低，在雌激素缺乏诱导的骨质疏松症模型中发挥一定的保护作用［36］。

目前ATP 对于破骨细胞的调节作用研究，仅局限于体外成骨-破骨细胞前体共培养的情况［31］，后续仍需进一步通过体内实验研究各种嘌呤能受体对于破骨细胞的影响。

2.3 嘌呤能受体对干细胞的影响

除了通常了解的成骨细胞和破骨细胞，干细胞也具备一定的成骨分化潜能，此功能会受到P2X7受体影响。当添加成骨诱导液和ATP 共同培养人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC）时，观察到细胞中成骨相关因子高表达。当成骨诱导液存在时，分别向不同的培养基中加入ATP 溶液和P2X7 受体特异性拮抗剂，与空白对照相比后可确定P2X7 受体经ATP 激活可使钙离子内流促进钙化，提高hPDLSC的成骨分化能力［40］。而前期研究［41-42］还发现，炎症微环境可降低P2X7 在hPDLSC 表面的表达，过表达或激活P2X7 受体可以通过PI3K-Akt-mTOR 信号通路及旁分泌外泌体的方式促进hPDLSC 成骨功能的恢复。这提示嘌呤能受体在调控干细胞分化过程中也发挥着重要的作用。

BMSC 是一类具有成骨分化功能的干细胞，在此类细胞上表达的P2Y 家族受体参与调控BMSC的成骨及成脂分化。体外分离培养大鼠的BMSC取第三代细胞，分别使用P2Y2 受体激动剂（ATP）、P2Y2 和P2Y4 受体小干扰RNA（siRNA）探究其功能，最终发现通过P2Y2 受体激活ERK1/2 信号通路促进BMSC 的成骨分化，同时抑制成脂分化［21］。P2Y13 受体对ADP 敏感，研究［43］发现来自小鼠的P2Y13R+/+贴壁BMSC 被ADP 激活后使碱性磷酸酶集群式形成单元（CFU-ALP）和某些成骨细胞标志物表达有所增加。P2Y14受体在骨重建中的作用尚不明确，从未分化细胞到成骨细胞的分化过程中，P2Y14 受体的表达随之降低，提示P2Y14 受体可能在早期分化阶段起到一定的调节作用。更有学者推测，该受体早期的表达可能与早期维持各类干/祖细胞的功能相关［43］，但仍需进一步验证。

3 嘌呤能受体在骨组织相关疾病中的作用

嘌呤能受体在成骨、破骨及骨相关干细胞中的多种功能与复杂作用反映出嘌呤能受体对于骨稳态调节的重要作用。而嘌呤能受体表达受损或失衡则会引起相应的骨组织相关疾病。

3.1 骨关节疾病

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨病变为代表病理学特征的一类关节软骨疾病［44］，此病的发生与先天免疫系统失衡相关。OA 患者关节腔内软骨细胞所处微环境中ATP 水平升高，会激活P2X3 受体，诱导与疼痛相关的PGE2 和NO 释放。另外，在各种免疫系统中高表达的P2X7 受体也参与炎症调节及疼痛。若细胞外ATP 浓度过高，激活的P2X7受体会加重炎症过程，其介导的IL-1β释放以及其进一步诱导的TNF-α均能够促进OA细胞凋亡［31，45］。此外，当P2X7 受体被激活后，其下游NFκB/NLRP3 通路的激活也会促进软骨细胞的细胞外基质的降解；两者共同作用导致软骨细胞失衡、病情加重［46］。在由OA 引起的膝关节病变中，软骨细胞的状态与病情发展紧密相关，阻断P2X7 受体的激活或表达将有利于OA 患者关节软骨细胞的存活。另一项研究［47］发现在有膝关节症状的OA 患者滑膜成纤维细胞中P2X4 受体功能性表达，介导脑源性神经营养因子表达引起疼痛。

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的慢性炎症性关节疾病。成纤维样滑膜细胞介导的炎症与RA 的发生密切相关。当存在炎症因子IL-1β 诱导时，原代成纤维样滑膜细胞中的P2Y11 受体出现剂量依赖性的表达增多，增强促炎细胞因子TNF-α 和IL-6 的表达，加重关节腔局部炎症反应；而特异性拮抗剂NF340 阻断P2Y11 受体后能削弱促炎因子表达控制炎症［48］，这提示P2Y11受体或可作为RA治疗靶点。

3.2 骨质疏松

骨质疏松是人口老龄化相关的一种常见疾病，与雌激素水平下降、破骨细胞数目增加有关。而嘌呤能受体在其中发挥着重要的调节作用。

多项研究［49-51］发现，P2X7受体与骨质疏松的发病存在密切关系。如针对骨质疏松症患者的临床研究发现，P2X7受体基因的某些特定位点的单核苷酸多态性与骨质疏松易感性相关［49］。一项病例对照研究发现，P2X7R rs3751143AC 杂合子会降低ATP 介导形成的孔隙活性，还会损害ATP 诱导的阳离子通道开放，从而影响绝经期妇女患骨质疏松症的易感性［50］。此外还有研究［21，49］显示，雌激素水平下降会使TNF-α 表达增加，进而通过促进P2Y2 受体水平增加来抑制成骨细胞分化，并促进BMSC 分化为破骨细胞加重病症。另一种P2Y13 受体的敲除会导致破骨细胞数量明显降低，对雌激素缺乏诱导的骨质疏松症模型发挥一定的保护作用［36］。这些结果无不体现嘌呤能受体对于骨质疏松疾病的调节作用。但目前仍缺乏针对嘌呤能受体的骨质疏松症治疗药物，未来针对这方面的研究仍需进一步加强。

3.3 牙周炎

牙周炎是一种慢性疾病，通常由菌斑生物膜引起，牙槽骨的吸收破坏是此病显著的特征。在牙周炎大鼠模型中发现甲状腺功能减退可能与牙周炎的发生相关［52］。hPDLSC 属于成体干细胞，接触到牙槽骨时会表现出较强的成骨特性。炎症微环境会降低hPDLSC 表面P2X7R 表达，过表达或激活P2X7R 可以通过PI3K-Akt-mTOR 信号通路参与炎症环境中hPDLSC 的成骨向分化作用［41］。在此发现的基础上，研究者以腺病毒转染P2X7 基因的方式修饰细胞，将修饰后细胞与其他共存的常驻细胞共同培养后发现，在含有外泌体的培养条件下成骨相关基因（BMP、OCN、RUNX2）表达高于对照组，且ALP 活性以及骨矿化结节形成增多。这一结果证明P2X7 受体在炎症条件下通过分泌外泌体调节hPDLSC 成骨分化［42］。根据实验结果推断TGF-β/BMP 信号家族可能在此机制中发挥作用，而外泌体或将成为治疗牙周炎的方向之一。

此外，孙亚男等［53］的研究发现，外源性ATP 可激活P2X7 受体，并促进P2X7 受体的表达，P2X7 受体对hPDLSC成骨的调节是分阶段进行的。

3.4 骨组织相关肿瘤

在一些骨组织相关肿瘤中，嘌呤能受体也发挥一定的调节作用。如小鼠骨肿瘤疼痛模型中，P2X7基因敲除小鼠相较于C57 WT 小鼠并未发现骨肿瘤诱导的疼痛行为，其热痛觉过敏现象也并不明显［54］。而另一项实验通过免疫组化法筛选发现，P2X7受体蛋白在骨肉瘤细胞系中呈强阳性，激活后能增强骨肉瘤的生长和转移，使细胞更具有侵袭性［55］。

在转移性肿瘤中，骨转移是乳腺癌转移最常见的部位之一，研究［56］发现，通过ATP 下调CXCR4 和P2Y11 受体两个关键调节因子，能够抑制乳腺癌的骨转移。另外一项针对大鼠骨肿瘤痛的模型研究中发现，大鼠导水管周围灰质处P2X7 受体表达轻度升高，通过注射曲马多能够缓解大鼠肿瘤性痛行为，且这一效应具有剂量依赖性［57］。

这些结果提示，嘌呤能受体在骨组织相关肿瘤的调控中也发挥着一定的作用。尤其是对于一些骨组织相关肿瘤来说，嘌呤能受体还可以参与到肿瘤性疼痛的发生过程中去。

4 结语

嘌呤能受体数目众多，功能多样，在多种组织细胞中都有表达，发挥疼痛传递、免疫调节以及骨代谢调节等多种功能。此外，不同细胞对于同一种嘌呤能受体反应也不尽相同，反映出嘌呤能受体调控的复杂性与多样性。目前研究较为深入的主要是P2X4、P2X7、P2Y12 等受体，这些受体能够通过调控细胞内多条信号转导通路来完成对细胞功能的控制以及细胞分化的影响。但对于其他一些嘌呤能受体的研究，仍需进一步深入。

嘌呤能受体与骨组织代谢以及骨相关疾病关系密切，不仅体现在成骨、破骨细胞表面可以表达多种嘌呤能受体，更体现在这些分子会影响骨形成过程、骨组织形态以及骨小梁密度等多种指标。此外，嘌呤能受体对于免疫系统的调节也会间接影响骨组织代谢。目前，针对嘌呤能受体调节骨组织代谢的研究仍处于初始阶段，多种嘌呤能受体在骨稳态调节过程中发挥的作用仍需进一步探究。深入研究嘌呤能受体对于骨组织代谢的调节作用，以及不同嘌呤能受体之间的相互关系，对于可能的治疗靶点并开发相关药物具有重要意义。