酶法制备甘油二酯的研究进展

李 悦，钟南京，李洪广

(1.中山市人民医院 营养科, 广东 中山 528428; 2.广东药科大学 食品科学学院，广东 中山 528458)

甘油二酯(DAG)具有重要的生理功效，尤其是1,3-DAG，其被证实可抑制人体脂肪堆积，且具有安全、营养、人体相容性高等诸多优点[1]，被广泛应用于食品、医疗、化妆品等行业。以普通油脂为原料制取具有营养保健功能的DAG是近年来油脂研究开发的热点[2]。

DAG的制备方法主要为化学法和酶法[3]。传统化学法常采用碱(氢氧化钾/氢氧化钠等)作为催化剂，在高温下反应，其能耗高，反应产物中DAG含量相对较低、且不适于富含多不饱和脂肪酸的DAG的制备，此外高温操作容易产生缩水甘油酯，从而引发食品安全问题。相比而言，酶法具有反应条件温和、选择性强、环境友好、能耗低、副产物少等优点。因此，酶法制备DAG日益受到关注。

不同的脂肪酶具有不同的选择性、稳定性及底物活性[4]，产生的催化效果不同。 本文就国内外酶法制备DAG的研究现状进行了综述，着重阐明了如何提高酶促合成DAG的选择性，总结了脂肪酶在DAG生成中的关键问题，以期为DAG的工业化生产提供参考。

1 DAG及其功能特性

DAG是甘油中的两个羟基与脂肪酸酯化的产物。DAG有两种异构体，即1,2-DAG和1,3-DAG，两者以(3～4)∶(7～6)的比例在自然界形成平衡[3]。由于分子的空间效应，1,3-DAG比1,2-DAG具有更稳定的热力学性质，食用油中的1,2-DAG在高温处理过程中通过酰基转移转化为1,3-DAG，直至两者平衡[1]。一般天然油脂中甘油三酯(TAG)含量不低于90%(棉籽油除外，其TAG含量为87.0%)，DAG含量最高接近10%。不同来源的油脂其DAG含量不同，如棉籽油中DAG含量为9.5%，而橄榄油中DAG含量为5.5%[1,5]。

尽管DAG与TAG有相同的能量值和消化率[4]，但1,3-DAG可以抑制体内脂肪堆积，降低血清甘油三酯水平，降低餐后血脂和血红蛋白A1c，增加餐后脂类氧化，从而达到降低体质量的作用[6-8]。因此，DAG有利于减少与肥胖相关疾病(如动脉粥样硬化、糖尿病、高血压等)的发生。此外，与TAG相比，DAG含有一个亲水性的羟基，其双亲分子结构使其具有乳化性质，在食品、化妆品和制药工业中，DAG与单甘酯(MAG)可以协同作为乳化剂和表面活性剂[6]。例如：DAG可制备O/W乳液，用于蛋黄酱和沙拉酱；或作为W/O乳液的乳化剂用于人造奶油、涂抹酱、奶油馅料、配方食品、油炸食品及冰淇淋等[9]。DAG还可以作为脂肪晶体调节剂用作有机产品合成前体，如磷脂、糖脂、脂蛋白；作为药物前体，例如1,3-DAG缀合的苯丁酸氮芥用于治疗淋巴瘤，1,2-DAG缀合的(S)-(3,4-二羟基苯基)丙氨酸(L-Dopa)可以用于治疗帕金森病[10]；还可用于含脂肪食物中TAG晶体结构的改性及作为疏水性油脂将材料分离[11]。

2 酶法制备DAG

根据反应路线，制备DAG有酯化合成、甘油解、部分水解等反应途径。

2.1 酶促酯化合成DAG

游离脂肪酸(FFA)与甘油在脂肪酶催化下可以生成DAG，同时还生成部分MAG和TAG。适当的含水量是保持酶活性所必需的，但该反应是可逆的，过量的水会影响反应向酯化反应方向进行，及时去除生成的水可以使反应平衡向酯化反应方向进行，从而提高DAG含量，因此酯化反应合成DAG的关键之一是及时去除反应生成的水。前人已采用真空、氮吹以及加入分子筛、硅胶等方法除水。Xu等[12]在酶促酯化过程中采用真空泵及时去除反应混合物中的水，结果发现DAG含量由2.86%提升至89.87%。有研究表明，酯化合成DAG的反应中真空除水的真空度应当保持在一定范围内，不应该低于0.4 kPa[13]。另外，使用适度过量的甘油(底物脂肪酸与甘油摩尔比1∶1)脱除填充床中固定化酶颗粒所吸附的水分简便易行，可以提高脂肪酶在反应过程中的稳定性[14]，再结合真空除水使反应向生成甘油酯的方向进行。但是该反应生成的MAG更多，DAG含量较低，且甘油的增加，将会造成脂肪酶催化中心被覆盖，不利于脂肪酶催化反应。真空驱动-氮气鼓泡操作模式(vacuum-driven N2bubbling protocol)用于酶促酯化合成DAG已取得显著的效果。该模式将氮气引入反应器底部，通过氮气鼓泡以增加脂肪酸、甘油以及脂肪酶的接触，从而促进酯化反应进行；同时生成的水分被及时除去，使反应平衡向甘油酯合成的方向进行。该操作模式下1，3-DAG产率高达92%～96%，同时酶在该操作模式下的稳定性非常好，Novozym 435重复利用10次后，酶活损失很小[15-16]。分子筛也是常用的固体吸收方法，使用上流式酶填充床反应器进行酶促酯化反应，用分子筛脱水，辛酸转化率可以达到90.2%，DAG含量达到77.3%[17]。表1为近年来酶促酯化合成DAG的研究现状。

表1 酶促酯化合成DAG

续表1

从表1可以看出，脂肪酶使用较多的是Novozym 435。Lipozyme RM IM对酯化合成甘油酯也具有较好的催化效果，并且Lipozyme RM IM的1,3-位选择性强，而Lipozyme TL IM催化酯化反应的效果则较差[18]。真空驱动-氮气鼓泡(以及随后改进的空气鼓泡)操作模式取得的效果显著，不仅所得的DAG含量高，酶操作稳定性也非常好。另外，反应设备对酯化效果也有影响，如Hu等[17]研究发现，填充床反应器酯化反应生成的DAG较间歇式反应器多(DAG含量分别为77.3%和45.5%)，但是脂肪酸转化率则比间歇式反应器低(分别为82.3%和94.4%)。研究表明，超临界二氧化碳介质具有良好的传质性能，可使底物与酶更好地接触，降低底物对酶的抑制作用；动力学研究表明，酶促酯化合成反应遵循双底物乒乓机制，且超临界二氧化碳中甘油及脂肪酸的米氏常数与抑制常数均小于有机溶剂体系中的[21]。在极低的酶质量浓度下(超临界二氧化碳介质中酶质量浓度仅为0.34 g/L，相比较有机溶剂体系中酶质量浓度为1.73 g/L)，超临界二氧化碳介质中棕榈酸的转化率、DAG产率(81.0%，56.2%)均高于有机溶剂体系(68.8%，41.4%)[21]。通过使用气体膨胀液体的方法可以改变体系物理化学性质如黏度、介电常数、氢键，从而促进酯化反应[29]。研究表明，在酶促酯化油酸与甘油合成DAG体系中，使用低共熔体(DES)作为溶剂，将氯化胆碱(CHCl)加入后可以显著提高酶对DAG的选择性。使用Novozym 435催化油酸与甘油酯化反应，以CHCl-DES作为溶剂可在反应1 h内获得含量为42.9%的1,3-DAG，其原因是氯化胆碱影响脂肪酶的区域选择性和化学反应平衡，可以抑制酰基转移，提高对1,3-DAG的选择性[23]。

2.2 酶促甘油解反应制备DAG

酶促甘油解反应是指在游离或固定化酶的催化下TAG与甘油的反应。甘油解反应过程简单、原料来源容易，是制备甘油酯(MAG和DAG)的主要反应路径[20]。表2为近年来酶促甘油解反应制备DAG的研究现状。

表2 酶促甘油解反应制备DAG

提高酶促甘油解反应对DAG的选择性是研究热点，目前温度控制法和溶剂化作用法已取得较大的进展。温度控制法是通过控制反应体系的温度，使目标产物DAG选择性凝固析出，从而使平衡向目标产物DAG生成的方向移动，如Yamane等[30]以氢化牛油为原料，通过控制酶催化甘油解反应的温度(48～60℃)，经过长时间(>3 d)反应，产物中DAG产率高达90%。但是由于反应时间长、脂肪酶与DAG不能有效分离，尤其是制备不饱和脂肪酸为主的DAG，其凝固点很低，反应几乎不可进行，因此温度控制法不能用于工业化生产。

溶剂化作用法是通过加入适当的溶剂于反应体系中，使反应体系中各物质的化学势、活度系数、活度等性质发生变化，从而引起平衡组成的改变[42]。Kahveci等[32]在这方面进行了深入研究，其中采用[TOMA]·[Tf2N]/Ammoeng 102离子液体时，DAG产率达73%。用于DAG生产的离子液体具有以下结构特征:①其阳离子应该具有疏水性，[TOMA]·[Tf2N]的结构中阳离子含有3个辛基，增加了[TOMA]·[Tf2N]的疏水性，从而可在高浓度下溶解TAG，提高甘油解反应中TAG的转化率；②其阴离子的极性不能太强，以便抑制MAG的生成，使反应产物停留在DAG阶段，从而提高反应对DAG的选择性，得到高含量的DAG。鉴于离子液体具有相对较高的黏度，对反应有很大的限制，因此可向离子液体中添加有机溶剂以降低体系黏度，从而加快反应速度。 Kahveci等[32]在二元离子液体系统的基础上加入正己烷，可进一步提高TAG转化率和DAG产率，与不加正己烷的二元离子液体系统相比，TAG的转化率提高了32.1%，DAG产率提高了15.1%，主要原因是黏度降低导致传质增强。但由于有机溶剂会引起环境污染同时增加工艺成本，所以这种二元系统并没有进一步应用。

此外，固定化酶的载体性质也可以影响酶促甘油解反应效率和选择性。当固定化脂肪酶载体为亲水性载体时，载体周围容易形成亲水性甘油层，从而限制脂肪酶接触疏水性的油相，导致反应难以进行[33]，例如：将Candidaantarctica脂肪酶B(CALB)固定在丙烯酸树脂(为疏水性载体)上可以催化鱼油的甘油解反应，获得42%的DAG；然而，将CALB固定在大孔阴离子交换树脂(为亲水性载体)上，并没有发生甘油解反应，当甘油逐渐加入时反应才能进行，但获得的DAG产率仅为19%，即使将甘油吸附在硅胶上，DAG含量仍然低于CALB固定在大孔丙烯酸树脂上催化的甘油解反应。就酶促甘油解对DAG的选择性而言，载体的疏水性适中更有利于提高DAG的选择性，而并不是疏水性越强DAG的选择性越高[34]。近年来介孔材料作为固定脂肪酶载体催化甘油解反应受到关注。其中SBA-15在近年来被广泛使用，它是一种有序的六边形介孔分子筛，其孔道表面有丰富的硅羟基，适用于表面改性后特定的催化反应[43]。Cai等[35]采用SBA-15作为载体固定CALB，催化玉米油甘油解反应，获得的DAG含量达到53.6%。为进一步提高DAG的选择性，课题组在载体修饰上展开了系列研究，包括(咪唑基)离子液体和有机功能基团修饰载体SBA-15。其中采用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐修饰SBA-15后负载CALB(CH3-IL-BF4-SBA-15-CALB)，其催化甘油解所得DAG 含量和DAG与MAG 比值分别达67.2%和13.4，DAG选择性得以较大提高[34]；但是在SBA-15直接负载CALB或咪唑基离子液体修饰SBA-15后再负载CALB，其催化甘油解反应均需在溶剂(采用了叔丁醇溶剂)辅助下才可以进行；而采用有机功能基团修饰SBA-15后再负载CALB或RML，其催化甘油解反应均可在无溶剂体系下进行并可得到相对较高的DAG含量。其中异氰酸丙基修饰SBA-15后再负载CALB催化甘油解反应，DAG含量为61.9%[36]，而异氰酸丙基修饰SBA-15后再负载RML催化甘油解反应，DAG含量为59.03%[37]。

2.3 酶促水解反应制备DAG

酶促水解反应是指在酶作用下，将TAG部分水解释放出FFA，生成产物DAG和MAG，彻底水解将得到甘油和FFA。酶促水解反应制备DAG的研究现状见表3。

表3 酶促水解反应制备DAG

续表3

酶促水解法制备DAG过程中，通过控制反应条件(如水分含量)，可以获得较高含量的DAG。水解法制备DAG过程简单，无需增加其他底物，易于生成，但是需要控制好反应条件，且产物中含有的FFA需要进一步分离。酶促油脂水解属于脂类-水界面反应，界面大小直接决定着反应速度。油在水中分散越细，界面越大，反应速度越快，而搅拌速度、油水比例以及乳化剂用量均影响界面大小，此外高速搅拌条件下可以克服反应的传质限制，有利于提高反应速度[52]。反胶束是表面活性剂分子在非极性有机溶剂中自发形成的具有热力学稳定性的纳米级聚集体，其内部有一个极性核，便于水在极性核中的溶解。研究表明，使用反胶束系统不仅可以提供大量界面区域，还可提供足够的水分子保护酶避免其在非极性环境中失活[53]。此外，不同的脂肪酶催化水解反应的效果也不一样。Mardani等[44]研究对比了Lipozyme TL IM、脂肪酶A、脂肪酶AY、Lipozyme RM IM、Lecitase Ultra催化棕榈油水解反应，结果表明，Lipozyme RM IM催化所得DAG含量最高(40.8%)，而Lecitase Ultra水解最为彻底，可获得高含量的FFA(94.5%)。添加表面活性剂可增加油相和水相表面的接触，从而有利于酶促反应的进行，但将其从反应产物中分离会增加经济负担[45]。此外，微波辐射可以提高传质速度，反应体系在适度流速下，持续给予微波加热，可促进反应底物与酶的接触，同时还可以避免反应过程中由于酶的聚集形成高浓度聚合物而导致的酶失活[46]。利用超声波空化可以提高非均相反应速度，超声波可以减少酶促反应中的传质限制，主要通过改变酶的性质，增加底物与酶的反应面积从而提高酶促反应效率[54-55]。采用固定化酶催化水解反应中，固定化酶载体的性质会影响催化水解的效率，惰性疏水性凝胶载体包埋的脂肪酶，其催化水解大豆油的活性较高[56]，而亲水性载体如阴离子树脂会吸附过量的水分，导致底物TAG不能到达脂肪酶分子，影响脂肪酶活性位点作用于油-水界面[57]，所以水油比例也是决定油部分水解的重要因素，并非油水比例越低水解程度越高[58]。

3 结束语

富含DAG的油脂具有显著的生理功效，可以减少人体对TAG的吸收。已经有大量研究采用不同方法制备富含DAG的油脂，以提高其经济性。本研究回顾分析了酶促反应制备DAG的方法，酶法制备DAG具有反应条件温和、选择性较强、对环境友好、能量需求较少、副产物少的优点。但鉴于目前酶法制备DAG工业化生产成本较高，酶的稳定性不足，DAG的含量不高等因素，需要进一步优化酶法制备DAG的工业化条件。