动物乳中四种主要蛋白结构功能及其分离纯化方法研究进展

马小梅，苏津贤，陈 遥，舒星富，张海霞，马忠仁

(1.西北民族大学 生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

动物乳质蛋白是一类富含多种必需氨基酸、营养成分丰富、具有诸多生理功能的优质蛋白，尤其在天然牛羊初乳中含量最高，如乳铁蛋白、α-乳清蛋白、酪蛋白等，具有抗菌、免疫活性调节等多种生物学功能[1].随着对乳质蛋白结构与功能研究的深入，采用多种方法进行分离提纯，如层析、色谱、沉淀分离、等电点分离及膜分离法等，期望获得更高纯度的蛋白，并为后续蛋白质的进一步研究及乳制品开发奠定了基础.本文就酪蛋白、乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的结构功能及其分离纯化方法进行综述，为相关蛋白质的研究提供参考依据.

1 酪蛋白的结构特征及其功能

酪蛋白(Casein，CN)约占哺乳动物乳中总蛋白的80%，又称干酪素，主要由乳腺上皮细胞合成，其中富含磷和钙，对酸敏感，pH较低时容易发生沉淀；CN在组成和结构上是一种分布不均一的混合体，主要分为αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN[2].

αs1-CN是由199个氨基酸组成的一种单链蛋白，约占牛奶总蛋白的42%，含有8个(as-CN-8P)或9个(as-CN-SP)磷酸化丝氨酸残基，是钙敏性蛋白质的主要特征[3]；αs2-CN由223个氨基酸组成，约占牛奶总蛋白的10%，其结构中含有三簇带负电的磷酸丝氨酸、谷氨酸残基，极性部分可以形成随机螺旋的二级和三级结构，其C端疏水区域较小，因此属于最亲水的CN[4].在牛乳中，β-CN含量仅次于αs1-CN，含209个氨基酸残基，具有明显的两极特性[5].κ-CN含169个氨基酸和1个磷酸基团，含量占比少，因其含苏氨酸糖苷化残基及少量磷酸丝氨酸簇，故κ-CN在溶解性方面对钙离子低敏[4]4-17.

CN可为人体补充必需蛋白质和金属矿物质等，具有较高的营养价值，主要应用于高脂类食品、乳饮料的生产加工，以增加商品价值，还可广泛应用于婴幼儿乳粉、工业用胶水、生物活性肽等生产[6].

2 乳铁蛋白结构特征及其功能

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是由哺乳动物外分泌腺和中性粒细胞分泌的铁结合型阳离子糖蛋白[7].约为700个氨基酸组成的单一多肽链，含两条富含精氨酸和赖氨酸的碳水化合物侧链，形成由α-螺旋残基连接的两个近似球形结构，其上分别携带一个糖基化位点和可结合两个Fe3+的结合位点，该位点还能结合脂多糖、肝素、DNA和金属离子等[8-9].研究发现，人、牛、马、骆驼等9种哺乳动物体内的LF具有高度同源性，具有高碱性pH和内部序列的两倍重叠等特征[10].

LF不仅参与机体铁的转运代谢，而且具有抗微生物活性、抗氧化、抗炎症等功能[11].LF同时具有免疫调节作用，通过与细胞因子和免疫细胞互作诱导体液免疫应答[7]1510-1515.大量试验研究表明，LF介导神经营养因子通路，降低神经炎性反应、促进机体正常代谢及体液免疫[12].Han等[13]通过CRISPR/Cas 9技术重组构建了αs1-CN位点特异性敲除猪LF基因的转基因白猪，体外活性检测证明该转基因猪乳具有抗菌活性.LF的广谱抗病毒活性对DNA、RNA病毒等均有抑制作用.LF可通过自组装形成具有抗逆转录病毒活性的纳米颗粒载体，用于开发LF抗病毒纳米粒子药物载体；Senapathi等[14]研究发现用磺酸盐对LF-MES(2-巯基乙磺酸钠)纳米颗粒进行表面修饰，得到的LF-MES纳米粒子对HIV-1抑制活性良好.

3 α-乳白蛋白结构特征及其功能

α-乳白蛋白(α-Lactalbumin，α-La)在乳腺中合成，占牛乳清蛋白的五分之一.α-La单链中含有8个半胱氨酸和123个氨基酸残基，分子量为14.2 KDa，为结构紧密的球蛋白[15]；α-La分子的第73位和91位氨基酸残基形成的半胱氨酸桥将α-螺旋和β-折叠连接起来，同时形成Ca2+结合位点[16].

α-La是惟一能与金属元素结合的乳清蛋白成分，黄美佳等[17]发现Ca2+结合α-La能使α-La的空间构象、抗体结合能力等发生改变，证实了金属离子对α-La的稳定性和结构具有重要的影响.α-La作为辅酶与乳糖合成密切相关，控制着乳腺中乳糖的含量，是泌乳阶段的一个重要调节因子.α-La也是人体所需营养物质的重要蛋白质来源，Markus等[18]研究发现，色氨酸的摄入有助于改善婴儿睡眠，促进婴幼儿的神经发育.

4 β-乳球蛋白结构特征及功能

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)约占乳清蛋白的50%，主要以二聚体形式存在于多种哺乳动物乳汁中，呈水溶性[19]，其蛋白质多肽链中含有162个氨基酸残基、2个S-S和1个-SH，分子量约为18 kDa，属于脂质转运蛋白[20].β-Lg二级结构由α-螺旋、β-折叠和无序结构组成，三级结构单体近似球状，连接紧密，在pH为7时，形成由8条反平行链组成β-桶状结构，并且结构表面有1个含有3个转角的α-螺旋和9条β链[21].

β-Lg作为生物活性肽的极好来源，具有与LF相似的生物活性功能[22].Zhao等[23]利用真空低温条件合成的新型有机硒化合物Se-β-Lg诱导H22细胞活性，发现Se-β-Lg在体内外均有诱导H22肿瘤细胞凋亡的能力，Se-β-Lg还可以用作食品中的功能复合物.β-Lg与叶酸结合可以增强其稳定性.Perez等[24]研制了一种热诱导β-Lg聚集体，该聚集体可与脂溶性维生素和脂肪酸等亲脂性分子结合，作为VA等脂溶性维生素的载体，可以用于生产乳质营养品，改善产品风味，促进营养物质吸收.

5 乳蛋白常用的分离提纯方法

5.1 酪蛋白分离纯化方法

5.1.1 沉淀分离法

沉淀分离技术包括有机、无机、等电点沉淀分离法等，其操作简单、经济，原料易获得，但对复杂原料，所得产物中杂质含量较多，产品纯度低，且选择性不强.因此只适宜于小规模蛋白乳制品生产.2006年，国内专利报道了在不同分离条件下沉淀α-CN和β-CN的方法，并应用于食品加工[25].Kern等[26]使用天然磷酸酪蛋白酸盐作为起始材料，在基于碱性pH值下添加不同浓度的钙，从而实现对α-CN、β-CN和κ-CN的分级分离.

5.1.2 膜分离法

膜分离技术适合处理热敏物质，生产过程中无化学添加剂，耗能低且对操作温度要求低，属于一种纯粹、高效的物理分离法，但有时因为选择的滤膜孔径过小，容易造成膜孔的堵塞，无法实现目的蛋白的有效截留.Baoyu等[27]等使用微滤叠加陶瓷膜过滤法除去山羊乳的杂蛋白后，真空喷雾干燥得到的CN含量在70%以上.Schafer[28]在采用叠膜和金属盲板组成的中式规模过滤系统分离提纯血清蛋白和CN，与单层膜动态过滤系统MSD对比显示，DCF系统更适合于蛋白质的分离纯化.

5.1.3 酶水解法

目前，酶分离法主要用于CN的分离提纯，酶源主要来自于动物、植物、微生物凝乳酶，CN首先在凝乳酶催化作用下转化为副CN(Paracasin).当反应体系中存在Ca2+时，副CN上的羟基结合Ca2+，在CN胶粒间形成一化学键，导致形成凝固乳沉淀下来与乳清实现分离[29].Sheryl等[30]使用木瓜蛋白酶和转谷氨酰胺酶的组合处理新鲜牛奶，在牛奶凝固后分离获得CN胶束.

5.1.4 色谱层析分离法

Aliah等[31]建立了两步色谱纯化法从山羊奶中分离纯化天然αS2-CN，通过LC-ESI-MS/MS测序分析表明，该法可成功应用于羊奶中天然αS2-CN的分离且纯度较高，有助于该蛋白的体外研究.Egito等[32]将马CN样品通过含琼脂糖的wheat germ agglutinin(WGA)和LichroCart C18色谱柱进行层析分离，实现了CN组分的分离.

5.2 乳铁蛋白分离纯化方法

5.2.1 盐析分离

使用高浓度盐溶液可使蛋白质溶解度降低，析出目的蛋白，且盐析过程可逆，不易引起蛋白质变性，该方法对设备要求低，操作简便，是分离提纯蛋白常用的方法.徐丽萍等[33]将超滤获得的牛乳LF粗品通过盐析处理，并结合柱层析后可获得纯度92%的LF.纪长谨等[34]将新鲜牛初乳离心脱脂除去CN后，产物使用不同饱和度的硫酸铵盐析，分离获得LF粗品，并用DEAE-Sepharose Fast Flow进一步纯化，获得纯度较高的LF.

5.2.2 超滤分离

超滤是根据膜孔径的不同，以达到不同分子质量和分子形状不同的大分子物质的分离，因此基于膜分离技术的超滤法也常应用于LF分离提取.刘秀清等[35]在免疫亲和柱层析基础上，结合超滤法浓缩LF，经检测其灵敏度高出其他方法数十倍.Kátia等[36]研究了超滤和阳离子交换扩张床色谱(EBC)联合使用法，一步法即可实现LF的分离纯化，得到了纯度较高的LF.

5.2.3 色谱层析分离

色谱法是目前提取高纯度LF的主要工艺，主要包括吸附、亲和、离子交换色谱法等.Bojana等[37]通过研究发现整体式离子交换色谱在LF来源的酸乳清工业加工具有较大潜力，可用于高附加值新产品的开发.LI等[38]将骆驼乳离心脱脂后，通过肝素亲和层析纯化制备LF，实现了LF的有效分离.混合模式吸附层析(mixed mode chromatography)是近几年开发的生物分离新方法，其功能基中兼有疏水基团和离子交换基团，具备静电和疏水相互作用，有明显的耐盐吸附特性，同时配基密度较高，适合于较低浓度体系中有效目标物的分离，分离效率较高，且生产成本低，具有广阔的应用前景[39].

5.3 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白分离纯化方法

5.3.1 酶水解法

由于α-La和β-Lg的结构不同，利用微生物来源的蛋白酶首先选择性水解β-Lg，而保留绝大部分α-La，再利用膜滤技术进行纯化即可得到α-La和β-Lg的分离产物.酶水解技术由于灭酶过程需要加热处理，α-La受热变性，同时可以降低β-Lg的致敏性.但该法α-La得率较低，纯度不高，因此多集中于实验室研究，工业化生产还需对酶的种类、灭活、水解程度等进行深入研究.

5.3.2 沉淀分离法

沉淀法除用于CN的分离提取外，对α-La和β-Lg也同样适用.Nicole等[40]在酸性条件下使α-La选择性热沉淀后进行高通量连续离心，获得了富含α-La的沉积物和99.7%纯度的β-Lg上清液.José等[41]建立了一种选择性热沉淀α-La后，再使用微滤和超滤分离β-Lg的中式规模分离方法，检测结果显示获得了纯度为91.3%的α-La和97.2%的β-Lg.Ayoa等[42]使用三种不同酸性介质(盐酸、柠檬酸、乳酸)来选择性沉淀α-La，研究发现，当在较低pH下添加柠檬酸时，上清液中几乎全为β-Lg.

5.3.3 色谱层析法

色谱层析法种类多、应用广泛，对生物医学领域产生了巨大影响.蛋白质的分离提纯中，色谱层析分离法通常与其他方法联用即可得到电泳效果单一的纯物质[43].Fucinos等[44]研发了一种一步式阴离子交换色谱法，从乳清蛋白分离物中纯化α-La，获得了近100%纯度的α-La和β-Lg.赵玉娟等[45]先将牛乳乳清经过硫酸铵沉淀初步分离，再利用双水相萃取系统与Sephadex G-75、DEAE离子交换层析，分离获得纯度高达85%的α-La和β-Lg.赵倩如等[46]采用Sepax-C8高效液相色谱柱对牛乳中α-La和β-Lg进行分离检测，获得的α-La和β-Lg回收率均良好.应有成等[47]建立了小规模Sephadex G-75凝胶层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析相结合的方法纯化牛乳中α-La和β-Lg，在此基础上，实现了α-La和β-Lg蛋白冻干产品的工业化生产.

6 展望

随着乳品产业的迅猛发展，动物初乳资源为食品工业生产蛋白乳提供了大量又经济的原料，同时蛋白乳具有重要的生理活性，发展潜力巨大.相关乳质蛋白的结构功能及其分离提取相关研究成为热点.

目前，由于国内在该方面的技术受限，但供应需求量大，因此基本依赖于进口，一直以来国外掌控着蛋白乳的巨大市场.急需进一步自主研发和完善国内动物蛋白乳的分离纯化及工业化生产[34]50-51.随着一些新兴分离技术的研发和各种技术交联使用，开发新型乳质蛋白的高效分离提取方法和大规模工业化生产的工艺，并将方法加以完善，从而实现乳质蛋白生产成本的降低，蛋白获得率和纯度的提高.