纳布啡改善瑞芬太尼诱导的大鼠痛觉过敏的机制

李洪影，庞红利，祁向雯

河南大学第一附属医院麻醉与围术期医学科，开封 475001

瑞芬太尼属于μ 型阿片受体激动剂，是一种起效快、代谢快的临床常用麻醉药，但其在发挥麻醉效应的同时，也会诱发痛觉过敏，导致患者术后疼痛敏化，加重患者的痛苦［1-3］。目前，瑞芬太尼诱导痛觉过敏的机制尚未明确，只能以镇痛药物治疗，其中以纳布啡的镇痛效果最为突出［4］。常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（euchromatic histone-lysineNmethyltransferase 2，EHMT2），又称G9a，属于组蛋白甲基转移酶，近期的研究发现［5］，G9a参与介导神经病理性疼痛的产生、维持、发展，而钠激活钾通道（KCNT1，Slack）与神经元兴奋性存在密切关系，故推测G9a、Slack可能参与了机体神经疼痛的发生过程。鉴于此，本研究建造了瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏反应模型，分析纳布啡对瑞芬太尼诱导的痛觉过敏的改善作用，并进一步探讨纳布啡对G9a、Slack表达的影响，为进一步研究纳布啡的具体镇痛机制、减轻瑞芬太尼诱导的痛觉过敏奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Ugo Basil机械痛敏测试仪、Ugo Basile热痛敏测试仪均购自上海溪拓科学仪器有限公司；BSF-80型荧光显微镜（上海巴拓仪器有限公司）。

1.2 试药

注射用盐酸瑞芬太尼（批号20181102，江苏恩华药业股份有限公司）；七氟醚（批号20181214，上海恒瑞医药有限公司）；金霉素软膏（批号20190118，长春翔通药业有限公司）；大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 试剂盒均购自上海钰博生物科技有限公司；兔抗大鼠胶原纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）单克隆抗体、兔抗大鼠G9a抗体、兔抗大鼠KCNT1（Slack）抗体、β-actin抗体单克隆抗体一抗均购自北京百奥莱博科技有限公司；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC，上海金穗生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔二抗（北京中山金桥生物有限公司）。

1.3 动物

SPF级雄 性SD 大 鼠，55 只，7 周 龄，体 质 量 为250～270 g，购自河南省实验动物中心，生产许可证号SCXK（豫）2017-0001。实验开展前适应性饲养1周，大鼠可自由进食、进水，环境温度维持在22℃±2℃，每日8∶00—20∶00 开灯，20∶00—次日8∶00熄灯。

2 方法

2.1 分组与造模

从55只大鼠中随机抽取30只，分为对照组、瑞芬太尼组、切口痛组，每组10只，其余25只建造瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏反应模型［6］，20 只造模成功的大鼠随机分为模型组、纳布啡组，每组10只。瑞芬太尼组、模型组、纳布啡组均用七氟醚吸入麻醉，再用体积分数为75%的乙醇消毒腹部皮肤，皮下刺入头皮针，以胶带固定，连接输液泵持续泵注瑞芬太尼0.04 mg·kg－1，0.8 m L·h－1，30 min，对照组仅输注等体积（0.4 m L）生理盐水，输注时间同上。各组完成输注5 min后，对切口痛组、模型组、纳布啡组进行左后足底切口术干预，即在左后足底进行碘伏消毒，用11号刀片从近端0.5 cm 开始向趾端取长约1 cm的切口，切开皮肤、筋膜后，挑起足底肌肉，纵向切割，保持起止附着点完整。用纱布按压止血，取5-0尼龙丝线缝合皮肤，切口处覆盖以金霉素软膏抗感染。瑞芬太尼组和对照组大鼠仅固定至手术台上相同时间。纳布啡组在泵注瑞芬太尼前3 min，静注0.6 mg·kg－1纳布啡，其他各组注射等体积生理盐水。造模成功的标准：与正常大鼠比较，造模大鼠造模后48 h 的机械缩足反应阈（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）、热缩足 反应潜伏 期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）下降。

2.2 大鼠痛觉行为学测定

在造模后6、12、24、48 h进行痛觉行为学测定，用Ugo Basile机械痛敏测试仪检测大鼠PWMT。将大鼠置于检测箱中，检测箱底部有金属网，待大鼠适应15 min后，将测试仪探针对准其左后足底切口附近，启动测试仪，若大鼠出现抬足行为则视为阳性反应，记录测试仪启动至大鼠抬足的测量值。每个测试重复3次，间隔5 min，计算平均测量值，即PWMT。用Ugo Basile热痛敏测试仪检测大鼠PWTL，将大鼠置于有玻璃底的箱内，适应15 min，调整测试仪的红外线热辐射探头强度，使其产生热量刺激大鼠10 s，将测试仪红外线探头对准足底切口，启动测试仪，记录测试仪启动至大鼠移开左足的时间，计算PWTL，计算方法同上。

2.3 酶联免疫吸附（ELISA）检测脊髓背角炎症因子

完成最后1次痛觉行为学检测后，将大鼠以颈椎脱臼的方式处死，快速剪开大鼠椎弓根，暴露脊髓组织，取大鼠左侧L4～6脊髓背角组织，保留在－80℃冰箱内。组织匀浆，4℃以1 500 r·min－1离心30 min，半径为10 cm，取上清液。按大鼠TNF-α、IL-1βELISA 试剂盒操作说明书操作，用酶标仪检测450 nm处的吸光度，根据标准曲线计算TNF-α、IL-1β的含量。

2.4 免疫荧光法检测脊髓背角星形胶质细胞的激活情况

大鼠处死后取出L4～5脊髓段，固定2 h，置于质量浓度为300 g·L－1的蔗糖溶液内（4℃）脱水3 d，制作厚25μm 的切片。用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3次，每次5 min。室温下以血清封闭，1 h后加入一抗，即抗GFAP 单克隆抗体（1∶200），次日用PBS冲洗后，加入FITC 标记的二抗（1∶200），室温下避光孵育，1 h后用PBS冲洗，随机挑选切片置于载玻片上，于荧光显微镜下用FITC滤镜观察、拍照。

2.5 脊髓背角G9a、Slack蛋白表达水平检测

用Western blot检测大鼠脊髓背角组织G9a蛋白、Slack总蛋白以及膜蛋白的表达水平。在大鼠脊髓背角组织内加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨为匀浆，在4℃以12 000 r·min－1离心10 min，离心半径为10 cm，取上清液，即脊髓背角组织总蛋白。用膜蛋白提取试剂盒，按说明书操作提取膜蛋白，并在95℃下变性5 min，用BCA 法检验蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，将膜置于质量浓度为50 g·L－1的脱脂牛奶中于室温下封闭2 h，洗膜后加入一抗，包括兔抗大鼠G9a抗体、兔抗大鼠KCNT1（Slack）抗体和β-actin抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜，用PBS清洗3次，每次5 min，加入HRP 标记的山羊抗兔二抗（1∶2 000），室温孵育2 h，用PBS清洗3次，每次5 min，置于暗室内加入发光试剂曝光，扫描成像。用Gene Tools图像分析软件进行条带灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的相对表达水平。

2.6 统计学方法

用SPSS 19.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本计量资料比较用单因素方差分析，两样本间的比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠造模后不同时间点的机械痛阈

随着造模时间的延长，瑞芬太尼组、切口痛组、模型组大鼠的PWMT 值持续降低，而纳布啡组PWMT 值持续增大（P＜0.05），对照组无明显变化（P＞0.05）；与对照组比较，瑞芬太尼组、切口痛组、模型组、纳布啡组大鼠的PWMT 值均减小（P＜0.05）；与瑞芬太尼组比较，模型组PWMT 值减小、纳布啡组PWMT 值增大（P＜0.05），切口痛组与之比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，纳布啡组PWMT值增大（P＜0.05）。结果见表1。

表1 大鼠造模后6、12、24、48 h PWMT值的比较（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of PWMT values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

表1 大鼠造模后6、12、24、48 h PWMT值的比较（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of PWMT values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与瑞芬太尼组比较，b P＜0.05；与切口痛组比较，c P＜0.05；与模型组比较，d P＜0.05；与6 h比较，e P＜0.05；与12 h比较，f P＜0.05；与24 h比较，g P＜0.05。

项目 PWMT／g 6 h 12 h 24 h 48 h对照组 21.32±1.28 20.75±1.08 20.39±1.47 20.63±1.14瑞芬太尼组 16.55±2.31a 14.45±1.74ae 13.05±1.79aef 12.01±1.28aefg切口痛组 15.25±1.79a 13.48±1.75ae 12.69±1.26aef 11.41±1.16aefg模型组 12.36±1.08abc 11.12±1.07abce 7.36±1.33abcef 6.25±1.15abcefg纳布啡组 17.39±1.35abcd 18.06±1.19abcde 19.47±1.03abcdef 20.39±1.17abcdefg F 40.537 74.430 147.853 278.538 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.2 大鼠造模后不同时间点的热痛阈

随造模时间的延长，瑞芬太尼组、切口痛组、模型组大鼠的PWTL值持续减小，而纳布啡组PWTL 值持续增大（P＜0.05），对照组无明显变化（P＞0.05）；与对照组比较，瑞芬太尼组、切口痛组、模型组、纳布啡组的PWTL 值均减小（P＜0.05）；与瑞芬太尼组比较，模型组PWTL 值减小、纳布啡组PWTL 值增大（P＜0.05），切口痛组与之比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，纳布啡组PWTL 值增大 （P＜0.05）。结果见表2。

表2 大鼠造模后6、12、24、48 h PWTL值的比较（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of PWTL values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

表2 大鼠造模后6、12、24、48 h PWTL值的比较（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of PWTL values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与瑞芬太尼组比较，b P＜0.05；与切口痛组比较，c P＜0.05；与模型组比较，d P＜0.05；本组各时间段比较，e P＜0.05。

项目 PWTL／s造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h 造模后48 h对照组 27.69±1.08 27.59±1.12 27.83±1.57 27.06±1.44瑞芬太尼组 18.05±2.01ae 17.95±1.49ae 15.45±1.99ae 14.71±1.88ae切口痛组 17.94±2.09ae 16.27±1.77ae 15.09±1.36ae 14.11±1.51ae模型组 15.42±1.22abce 14.29±1.67abce 12.06±1.34abce 10.28±1.05abce纳布啡组 20.42±1.55abcde 22.42±1.69abcde 24.09±1.75abcde 26.33±1.87abcde F 81.958 116.045 171.219 236.023 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.3 大鼠脊髓背角细胞炎症因子的表达

与对照组比较，瑞芬太尼组、切口痛组、模型组、纳布啡组大鼠TNF-α、IL-1β的水平升高（P＜0.05）；与瑞芬太尼组比较，模型组TNF-α、IL-1β的水平升高，纳布啡组TNF-α、IL-1β的水平降低（P＜0.05），切口痛组与瑞芬太尼组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，纳布啡组TNF-α、IL-1β的水平降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3 大鼠脊髓背角的细胞炎症因子表达水平的比较（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of expression of inflammatory cytokines in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

表3 大鼠脊髓背角的细胞炎症因子表达水平的比较（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of expression of inflammatory cytokines in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

注：与 对 照 组 比 较，a P ＜0.05；与瑞 芬 太 尼 组 比 较，b P＜0.05；与 切 口 痛 组 比 较，c P ＜0.05；与 模 型 组 比 较，d P＜0.05。

项目 TNF-α／（pg·mg－1）IL-1β／（pg·mg－1）对照组27.35±3.26 49.81±6.34瑞芬太尼组 55.18±6.77a 149.42±11.71a切口痛组 56.39±7.05a 150.08±10.66a模型组 69.82±9.64abc 186.05±19.25abc纳布啡组 39.97±5.37abcd 81.67±8.22abcd F 58.888 213.808 P＜0.001 ＜0.001

3.4 大鼠脊髓背角星形胶质细胞激活状态

与对照组比较，瑞芬太尼组、切口痛组的星形胶质细胞明显激活，模型组激活星形胶质细胞的密度最大，纳布啡组较瑞芬太尼组、切口痛组有所改善。结果见图1。

图1 大鼠脊髓背角星形胶质细胞激活状态（×200）Fig.1 Activation of astrocytes in spinal dorsal horn of rats（×200）

3.5 大鼠脊髓背角G9a、Slack总蛋白以及膜蛋白的表达

与对照组比较，瑞芬太尼组、切口痛组、模型组、纳布啡组G9a蛋白的相对表达量升高，Slack总蛋白与膜蛋白的相对表达量降低（P＜0.05）；与瑞芬太尼组比较，模型组G9a蛋白的相对表达量升高，Slack总蛋白与膜蛋白的相对表达量降低（P＜0.05），纳布啡组G9a蛋白的相对表达量降低，Slack总蛋白与膜蛋白的相对表达量升高（P＜0.05），切口痛组与之比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，纳布啡组G9a蛋白的相对表达量降低，Slack总蛋白与膜蛋白的相对表达量升高（P＜0.05）。结果见表4、图2。

图2 Western blot检测大鼠脊髓背角G9a、Slack总蛋白以及膜蛋白的表达水平Fig.2 Western blot detection of the expression levels of G9a，Slack total protein and membrane protein in the dorsal horn of rat spinal cord

表4 大鼠脊髓背角G9a、Slack总蛋白以及膜蛋白表达水平的比较（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of expression of G9a，Slack total protein and membrane protein in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

表4 大鼠脊髓背角G9a、Slack总蛋白以及膜蛋白表达水平的比较（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of expression of G9a，Slack total protein and membrane protein in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

注：与 对 照 组比较，a P ＜0.05；与 瑞 芬 太 尼 组 比 较，b P＜0.05；与切口痛组比较，c P＜0.05；与模型组比较，d P＜0.05。

项目 G9a Slack总蛋白 膜蛋白对照组0.92±0.05 0.93±0.06 0.91±0.07瑞芬太尼组 1.19±0.15a 0.69±0.08a 0.59±0.05a切口痛组 1.22±0.18a 0.55±0.09a 0.46±0.06a模型组 1.36±0.12abc 0.46±0.06abc 0.32±0.04abc纳布啡组 1.03±0.14abcd 0.81±0.05abcd 0.72±0.07abcd F 16.100 74.628 149.000 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4 讨论

瑞芬太尼可诱发痛觉过敏已被证实，目前其往往与其他药物联用麻醉，其中与纳布啡联用的频率最高［7］。纳布啡属于混合型阿片类受体调控剂，可激活κ型阿片受体，同时拮抗μ受体，缓解由μ受体激动剂所致的不良反应［8］。有研究发现［9］，纳布啡可预防瑞芬太尼全麻患者术后疼痛、寒战等的发生，因此推荐纳布啡为预防瑞芬太尼诱发痛觉过敏的一线药物。

本研究在大鼠吸入七氟醚、泵注瑞芬太尼麻醉的状态下进行切口手术，模拟目前广泛应用于人体的麻醉手术，结果显示，泵注瑞芬太尼、切口手术均可诱发明显机械性痛敏和热痛敏，泵注瑞芬太尼可在一定程度上加剧大鼠术后的疼痛感，而预先采用纳布啡可使大鼠术后PWMT 和PWTL 值上升，且伴随造模时间的延长，大鼠PWMT 和PWTL 值持续上升，表明纳布啡可改善由瑞芬太尼诱发的痛觉过敏。近20年来，诸多研究证明中枢、外周神经炎症在神经病理性疼痛的产生与维持中发挥重要作用，在个体发生炎症或者神经损伤后，神经胶质细胞，如中枢星形胶质细胞可迅速增生，释放大量炎症递质、细胞因子，影响神经元周围离子环境，突触间隙的兴奋性神经递质谷氨酸浓度提高，诱发中枢神经元敏感化［10-12］。因此，众多学者从抑制中枢星形胶质细胞活化、降低炎症因子水平出发，探索镇痛药物用于改善神经病理性疼痛的效果［13-14］。本研究结果显示，纳布啡组大鼠脊髓背角星形胶质细胞的密度明显低于模型组，更接近对照组，且TNF-α、IL-1β的水平明显低于模型组，表明星形胶质细胞激活、TNF-α与IL-1β释放参与了瑞芬太尼诱发痛觉过敏的产生和维持过程，而纳布啡可通过抑制星型胶质细胞活化、下调炎症因子水平达到镇痛的目的。

G9a是一种由EHMT2 编码、负责定位组蛋白甲基化位点的组蛋白修饰酶，在抑制基因转录方面的作用已经被人熟知，其可通过催化H3K9 的二甲基化（histone H3 lysine 9 dimethylation，H3K9Me2），调控神经元中钾离子通路表达沉默，这是神经病理性疼痛的表观遗传学相关机制［15-16］。神经损伤、炎症可诱发H3K9Me2上调，在钾离子通路启动子部位富集，抑制相关基因的转录，从而导致多种钾离子通路沉默［17］。本研究结果显示，模型组造模后48 h 的G9a蛋白水平上调，而纳布啡组G9a蛋白的水平下调，表明G9a通路参与了瑞芬太尼诱导痛觉过敏的形成过程，而纳布啡可下调G9a通路，这可能是纳布啡镇痛的作用机制之一。Slack通路是由KCNT1基因编码的钠离子激活的钾离子通路，广泛存在于谷氨酸能神经突触上，其所介导的钾离子外向电流，可降低神经元兴奋性，表现为兴奋性突触后膜电流、动作电位的振幅和频率下降［18］。Slack蛋白受到抑制后，可增强由氨甲基膦酸（aminomethyl phosphonic，AMPA）受体所介导的神经元兴奋性，抑制AMPA受体-Slack负反馈调控神经元的兴奋性，提高兴奋性谷氨酸突触后电位［19-20］。与对照组比较，模型组Slack总蛋白和膜蛋白的表达下调，表明Slack 通路也参与了由瑞芬太尼诱导的痛觉形成过程；与模型组比较，纳布啡组Slack总蛋白和膜蛋白的表达上调，表明纳布啡可通过上调Slack通路发挥镇痛效应。

综上所述，预先使用纳布啡可改善由瑞芬太尼诱导的痛觉过敏，可抑制星形胶质细胞活化、降低炎症因子水平，其可能是通过下调G9a、上调Slack的表达实现镇痛效果。