非洛地平纳米脂质载体在大鼠体内的药动学与药效学研究

曹桑博，王 敏，谢 鹏

1.唐山市协和医院药剂科，唐山 063000；2.唐山职业技术学院，唐山 063000

非洛地平（FLD）是一种二氢吡啶类钙通道阻滞剂，临床用于治疗高血压，该药具有血管选择性高、可显著提高肾脏血液灌注率、能有效减少对靶器官损伤的优势［1］。但FLD 属于生物制药分类系统（BCS）Ⅱ类药物［2］，其水溶性极差（＜0.5μg·m L－1）以及严重的肝脏首过效应，口服生物利用度仅为15%左右［3］，临床应用受到很大限制。纳米脂质载体（NLCs）具有显著增加难溶性药物溶解度、提高口服生物利用度的优势，是一种很有前景的口服给药系统［4］。本研究将FLD 制备成纳米结构脂质载体（FLD-NLCs），并通过大鼠体内药动学以及药效学实验评价其吸收效果。

1 仪器与材料

1.1 仪器

K2025高效液相色谱仪（山东海能科学仪器有限公司）；DF-101Q 系列集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；ETS-2高速匀浆机（常州亿通分析仪器制造有限公司）；NanoDeBEE 实验型微射流均质机（美国BEE公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪（英国Malvern公司）；JEM-F200场发射透射电子显微镜（日本电子株式会社）。

1.2 试药

非洛地平（合肥立方制药股份有限公司）；山嵛酸甘油酯（Compritol 888 ATO）和聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯（Solutol HS 15）均由嘉法狮上海贸易有限公司惠赠；泊洛沙姆188（Poloxamer 188）由巴斯夫有限公司惠赠；磷钨酸和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）均购自阿拉丁试剂有限公司；改良Eagle’s培养基（杭州铭特生物科技有限公司）；汉克平衡盐溶液（HBSS，武汉普诺赛生命科技有限公司）；p H1.2 盐 酸 溶液、p H4.5 醋酸盐 缓 冲 液和p H 6.8磷酸盐缓冲溶液（PBS）均为实验室自制；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 FLD-NLCs的制备

FLD-NLCs使用高压均质技术制备［5］。分别称取Compritol 888 ATO（固体脂质）6.7 g和Solutol HS 15（液体脂质）3.3 g，置于烧杯中，水浴加热至80℃～85℃形成油溶液；再称取FLD 0.4 g溶解到二氯甲烷溶液5 m L中，待药物完全溶解后加入到上述油溶液中，在80℃～85℃挥干二氯甲烷，形成药物油溶液，备用；另称取Poloxamer 188（表面活性剂）4 g加入到纯化水（80℃～85℃）100 m L 中，搅拌溶解，形成水溶液，备用；保持水浴温度在80℃～85℃范围内，将表面活性剂溶液加入到药物油溶液中，以15 000 r·min－1高速剪切5 min预处理，再将该溶液通过高压均质机处理，均质压力为600 MPa，均质6次，最终得到FLD-NLCs，于4℃储存备用。

2.2 FLD-NLCs质量评价

2.2.1 粒径分布、Zeta 电位测定 使用Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪测定FLDNLCs的粒径分布和Zeta电位，用移液枪移取FLDNLCs 100μL至样品池中，再加入去离子水2.5 m L稀释，摇匀，在25℃测定粒径分布和Zeta电位，每组样品重复测定3次，取平均值。经测定，平均粒径为（126.8±3.3）nm，多聚分散系数（PDI）为（0.184±0.005），Zeta电位为（－26.3±0.6）m V。

2.2.2 透射电子显微镜（TEM） 取经去离子水稀释50倍的FLD-NLCs样品滴加到formvar涂层的铜网格表面，均匀铺展，再向其滴加质量浓度为10 mg·m L－1的磷钨酸溶液，复染色10 min，室温下风干，在透射电子显微镜（加速电压为150 k V）下观察FLD-NLCs的微观形态，结果见图1。由图1 可知，FLD-NLCs为球形，形状规则，表面光滑，其粒径在50～150 nm 范围内，在视野内未观察到有粒子聚集以及药物颗粒。

图1 FLD-NLCs的透射电镜照片Fig.1 Transmission electron micrograph of FLD-NLCs

2.3 环境p H／稀释稳定性

FLD-NLCs经口服进入胃肠后，由于环境p H 值的改变可能会对其稳定性产生一定的影响，进而影响药物吸收［6］，因此，需要考察FLD-NLCs在不同p H环境中的稳定性。取FLD-NLCs分别使用p H 1.2盐酸溶液（0.1 mol·L－1）、p H 4.5 醋酸盐缓冲液、p H 6.8 PBS稀释50倍，定时取样观察外观并测定粒径，结果见表1。结果显示，FLD-NLCs经不同p H介质溶液稀释后放置9 h，其外观均为透明状、略带乳光溶液，未发现有药物沉淀析出，粒径也未发生显著变化，说明不同p H 溶液不会对FLD-NLCs的结构产生破坏作用，可推测FLD-NLCs在胃肠道内能够稳定存在。

表1 FLD-NLCs稀释稳定性结果（±s，n＝3）Tab.1 Dilution stability results of FLD-NLCs（±s，n＝3）

表1 FLD-NLCs稀释稳定性结果（±s，n＝3）Tab.1 Dilution stability results of FLD-NLCs（±s，n＝3）

介质 粒径分布／nm初始3 h 6 h 9 h p H 1.2盐酸溶液122.8±2.4 124.2±2.3 125.1±3.3 125.3±3.6 p H 4.5醋酸盐缓冲液 122.8±2.4 122.2±2.7 124.6±2.1 128.1±3.3 p H 6.8 PBS 122.8±2.4 120.3±3.1 124.8±3.2 123.4±2.7

2.4 体外药物释放研究

使用透析法考察FLD-NLCs分别在p H 1.2盐酸溶液（0.1 mol·L－1）、p H 4.5醋酸盐缓冲液、p H 6.8 PBS介质中的药物体外释放情况。取3份FLDNLCs，各5 m L，分别置于透析袋（截留相对分子质量为12～14 k Da）中并系紧，放入对应的3种p H 值介质溶液（体积均为245 mL）中，水浴加热至37℃±0.5℃并保持恒温，磁力搅拌速度设置为100 r·min－1，分别在实验开始后的0.5、1、2、4、6、12、24 h取出释放介质5 m L（同时补加相应p H 值介质溶液），并经过滤和稀释，检测药物含量，计算药物释放度，见表2。结果显示，FLD-NLCs在p H 1.2盐酸溶液、p H 4.5醋酸盐缓冲液和p H 6.8 PBS介质溶液中的相同时间点药物释放度相似，均表现为双相释放模式［7］，即前2 h药物表现为突释模式，接下来药物呈现持续的缓释模式；释药数据经零级、一级、Higuchi和Korsmeyer-Peppas模型拟合［8］，采用相关系数R2值接近1的模型来推测药物释放机制，结果见表3。拟合结果显示，释药曲线最适合Higuchi模型，说明药物释放机制为扩散和溶蚀双重控制［9］。

表2 FLD-NLCs在不同p H 值介质溶液中的体外药物释放度（±s，n＝6）Tab.2 In vitro dissolution of FLD-NLCs in p H1.2，p H4.5 and p H6.8 media（±s，n＝6）

表2 FLD-NLCs在不同p H 值介质溶液中的体外药物释放度（±s，n＝6）Tab.2 In vitro dissolution of FLD-NLCs in p H1.2，p H4.5 and p H6.8 media（±s，n＝6）

t／h累积释放度p H 1.2盐酸溶液p H4.5醋酸盐缓冲液p H6.8 PBS 0.5 11.9%±2.7% 10.1%±2.9% 9.3%±3.5%1 26.6%±3.1% 25.3%±1.7% 27.2%±2.7%2 34.8%±3.5% 34.8%±3.6% 37.5%±3.1%4 39.3%±2.9% 39.9%±2.4% 42.4%±2.2%6 44.1%±1.7% 43.3%±3.3% 45.7%±1.6%12 62.3%±2.8% 58.4%±4.1% 63.4%±3.6%24 88.9%±3.0% 85.8%±3.6% 88.9%±2.7%

表3 不同释药模型拟合结果Tab.3 Fitting results of different release models

2.5 细胞转运实验

2.5.1 人克隆结肠腺癌细胞（Caco-2 细胞）毒性评价 通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）评估空白NLCs和FLD-NLCs与Caco-2细胞的相容性［10］。将处于对数生长期的Caco-2 细胞按照细胞密度为1.0×105个·m L－1接种到96孔培养板中，每孔加入Caco-2 细胞液100μL，再加入改良Eagle’s培养基（培养基含有100 mg·m L－1灭活胎牛血清和10 mg·m L－1青霉素／链霉素）100μL，并置于二氧化碳培养箱中在37℃培养24 h，向96孔培养板中分别加入空白NLCs和FLD-NLCs，脂质质量浓度分别为5、10、20、50、100、200 mg·m L－1，并选择纯化水作为对照组，继续培养24 h，去除培养液，每孔加入质量浓度为0.5 mg·m L－1MTT 各100μL，培养4 h，每孔再加入二甲基亚砜（DMSO）各150μL溶解甲臜沉淀，使用酶标仪在570 nm 处测定各孔的吸光度值A，并计算细胞存活率，每组实验重复进行3次，结果见表4。

表4 空白NLCs和FLD-NLCs对Caco-2细胞的毒性（±s，n＝3）Tab.4 Cytotoxicity of blank NLCs and FLD-NLCs to Caco-2 cells（±s，n＝3）

表4 空白NLCs和FLD-NLCs对Caco-2细胞的毒性（±s，n＝3）Tab.4 Cytotoxicity of blank NLCs and FLD-NLCs to Caco-2 cells（±s，n＝3）

脂质质量浓度／（mg·m L－1）细胞存活率空白NLCs FLD-NLCs 5 98.6%±1.5% 98.1%±1.3%10 98.2%±1.7% 97.4%±0.7%20 97.4%±0.7% 96.6%±0.8%50 96.8%±1.2% 95.8%±0.7%100 94.1%±0.9% 93.7%±1.0%200 93.7%±1.1% 92.5%±1.1%

结果显示，在考察的脂质质量浓度范围内，空白NLCs组和FLD-NLCs组的Caco-2细胞活性均高于90%，表明在此质量浓度范围内空白NLCs和FLDNLCs具有良好的生物相容性［11］。

2.5.2 转运实验研究 将生长状态良好的密度为1.0×105个·m L－1的Caco-2细胞接种于Transwell 24孔微孔滤膜培养板上，加入培养基并置于二氧化碳培养箱中在37℃条件下培养，每隔48 h更换培养基，培养21 d后去除培养基，使用汉克平衡盐溶液（HBSS）清洗2次，测量荧光黄的跨膜渗透率为3.57×10－7cm·s－1，小于通透性实验规定值（0.5×10－6cm·s－1），说明Caco-2细胞已经形成了完整和紧密的单细胞层，可用于转运实验研究［12］。考察药物从Caco-2细胞顶端（AP）至基底外侧（BL）的转运实验如下：在AP 面加入含有FLD 原料药或FLD-NLCs（药物质量浓度均为100μg·m L－1）的HBSS溶液，各0.5 m L，作为供给池，在BL 面加入HBSS 溶液1.5 m L，作为接收池；顶端（AP）至基底外侧（BL）的转运实验如下：在BL 面加入含有FLD 原料药或FLD-NLCs（药物质量浓度均为100μg·m L－1）的HBSS溶液，各0.5 m L，作为供给池，在AP 面加入HBSS溶液1.5 m L，作为接收池。孵育4 h后从接收池中吸取药液0.2 m L，检测药物含量，按照公式计算表观渗透系数（Papp），结果见表5。

表5 FLD原料药和FLD-NLCs在Caco-2细胞单层中的渗透性（±s，n＝3）Tab.5 Apparent permeability coefficients of FLD and FLDNLCs in Caco-2 cells monolayer（±s，n＝3）

表5 FLD原料药和FLD-NLCs在Caco-2细胞单层中的渗透性（±s，n＝3）Tab.5 Apparent permeability coefficients of FLD and FLDNLCs in Caco-2 cells monolayer（±s，n＝3）

项目 P app／（×10－6 cm·S－1）P app（AP→BL） P app（BL→AP）FLD 原料药4.37±0.32 6.78±0.41 FLD-NLCs 13.64±0.52 5.83±0.38

Papp＝dQ／dt×1／A×1／C0。其中dQ／dt表示转运速率（μg·s－1），A表示微孔滤膜的表面积（cm2），C0表 示 顶 端 初 始 药 物 质 量 浓 度（μg·m L－1）。Papp（AP-BL）表示FLD 从AP面至BL面的表观渗透率，Papp（BL-AP）表示FLD 从BL面至AP面的表观渗透率。

结果显示，将FLD 制备成FLD-NLCs 后，其Papp（AP→BL）值由原料药组中的（4.37±0.32）×10－6cm·s－1升高为FLD-NLCs组的（13.64±0.52）×10－6cm·s－1，渗透性显著提高，说明FLD-NLCs能促进Caco-2细胞对药物的转运吸收［13］。

2.6 药动学研究

2.6.1 血样处理及检测 取大鼠血清100μL，加入饱和碳酸钠溶液50 μL，涡旋2 min，加入乙醚500μL，涡旋5 min，样品溶液以5 000 r·min－1离心10 min，收集上层乙酸乙酯溶液，并在氮气环境中挥发，残留物用流动相100μL复溶，以10 000 r·min－1离心10 min，取上清液20μL，按照以下色谱条件检测FLD 含量［14］：色谱柱为Agilent ODS C18（250 mm×4.6 mm），流动相 为乙 腈-水（65∶35），流 速 为1.0 m L·min－1，检测波长为254 nm，柱温为30℃。HPLC方法学验证了线性、方法精密度、日内／日间精密度、提取回收率、检测限和定量限，均符合生物样品检测的质量要求。

2.6.2 动物实验 选择体质量为200～250 g 的Wistar大鼠，雌雄各半，每组6只，实验前12 h禁食，可自由饮水。2 组大鼠分别口服给予FLD 混悬剂（分散介质为5 mg·m L－1羧甲基纤维素钠溶液）和FLD-NLCs，给药剂量均为20 mg·kg－1，在给药后的第0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h通过眼眶后静脉丛穿刺取血，采用EP管收集约2～3 m L 血样，并以5 000 r·min－1离心10 min，上层血浆转移至另一个EP管中，并储存在－20℃冰箱中直至用于分析检测。使用DAS2.0药动学软件以单室模型拟合FLD混悬剂和FLD-NLCs在大鼠体内的血药达峰时间（tmax）、血药达峰质量浓度（Cmax）和药时曲线下面积（AUC（0～∞））等药动学参数，结果见表6。

表6 大鼠口服给予FLD混悬剂和FLD-NLCs的药动学参数（±s，n＝6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters in rats after oral administration of FLD suspensions and FLD-NLCs（±s，n＝6）

表6 大鼠口服给予FLD混悬剂和FLD-NLCs的药动学参数（±s，n＝6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters in rats after oral administration of FLD suspensions and FLD-NLCs（±s，n＝6）

注：－表示无此项数据；FLD-NLCs与FLD 混悬剂比较差异具有统计学意义（*P＜0.05）。

药动学参数 FLD 混悬剂FLD-NLCs t max／h 1.76±0.52 3.52±0.79*C max／（ng·m L－1） 774.20±104.6 1 445.70±146.2*AUC（0～∞）／（ng·m L－1·h－1）3 674.50±493.5 8 256.20±1059.4*相对生物利用度（F）／%－225

结果表明，口服给予FLD-NLCs的大鼠，与FLD混悬剂组比较，其tmax有所延后，Cmax和AUC（0～∞）较FLD 混悬剂组显著提高，半衰期（t1／2）也明显延长，口服生物利用度提高了2.25倍。

2.7 药效学研究

选择Wistar大鼠，雌雄各半，体质量为200～250 g，喂食果糖溶液（质量浓度为250 mg·m L－1）诱发高血压，2 周后，选择最小平均收缩压为140～145 mm Hg的大鼠作为高血压模型［15］。将Wistar大鼠分为A、B、C和D 4个组进行实验，每组6只，A 组大鼠（正常血压）为非治疗组阴性对照，B 组大鼠（高血压）为非治疗组阳性对照，C 组大鼠（高血压）为口服FLD 混悬剂组，D 组大鼠（高血压）为口服FLDNLCs组，给药剂量均为20 mg·kg－1，实验期间恢复正常饮食和饮水，使用尾套法［16］在不同的时间间隔（0、1、2、4、6、12、24、36、48 h）测定大鼠血压，结果见表7。

表7 大鼠口服FLD混悬剂和FLD-NLCs的抗高血压效果比较（±s，n＝6）Tab.7 The antihypertensive effect of FLD suspensions and FLD-NLCs after oral administration（±s，n＝6）

表7 大鼠口服FLD混悬剂和FLD-NLCs的抗高血压效果比较（±s，n＝6）Tab.7 The antihypertensive effect of FLD suspensions and FLD-NLCs after oral administration（±s，n＝6）

t／h 血压／mm Hg A 组 B组 C组 D组初始94.6±3.4 148.4±2.9 148.9±2.5 148.7±2.1 1 93.1±1.1 149.1±3.1 124.1±2.6 134.3±3.2 2 92.6±3.8 148.6±2.8 98.3±3.1 116.2±1.9 4 93.4±2.6 147.9±3.3 119.6±2.0 98.1±2.4 6 94.1±3.1 146.3±3.7 132.8±1.8 94.3±1.6 12 93.8±3.9 146.7±2.4 141.7±2.9 93.6±3.3 24 92.7±2.5 145.3±3.2 141.3±1.6 96.7±2.6 36 94.6±2.2 144.6±2.5 140.4±2.5 113.5±1.4 48 93.5±3.0 143.6±2.3 139.6±1.9 126.1±2.8

大鼠药效学研究结果显示，非治疗组（A 组）的大鼠在实验期间血压非常平稳，说明正常饮食不会对大鼠血压产生波动；而非治疗组中的高血压模型大鼠（B组）恢复正常饮食后在实验期间收缩压出现微弱降低趋势，但依然很高；口服FLD 混悬剂的高血压大鼠（C组）在给药后2 h血压迅速降低，但随后血压逐渐升高，在第6 h后血压基本恢复至治疗前水平，血压波动较大，降血压时间较短；相比之下，口服FLDNLCs的高血压大鼠（D 组）在给药后血压逐渐降低，第6 h达到最大治疗效果，并一直持续到第24 h，说明FLD-NLCs能够明显延长降血压时间。

3 讨论

非洛地平由于存在溶解度低、吸收性差、代谢快等诸多不利因素，导致口服生物利用度低，血药浓度波动较大，疗效不确切。而近年来新型纳米给药系统（如：胶束、脂质体、微乳、纳米混悬剂以及聚合物纳米粒）在增加难溶性药物口服生物利用度方面得到了广泛应用，然而这些给药系统存在物理稳定性较差、易聚集、储存时药物泄漏、难以扩大生产等缺点。以脂质作为载体的纳米给药系统，可以增加药物溶解性，促进药物吸收，对提高难溶性药物的溶解度和生物利用度存在明显优势。因此，本研究以Compritol 888 ATO 和Solutol HS 15作为脂质载体将非洛地平制备成纳米脂质载体。实验结果显示，制备的FLDNLCs粒径为（126.8±3.3）nm，PDI为（0.184±0.005），Zeta电位为（－26.3±0.6）m V，在p H1.2、p H4.5和p H6.8 3种释放介质中均表现为双相释放模式，FLD-NLCs提高了药物的渗透性，并显著改善了药物的口服生物利用度以及降血压效果，这归因于FLD-NLCs能够有效透过肠上皮细胞膜，降低了药物外排作用，提高了药物的生物利用度。