超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇残留量的方法优化

钟名琴，陈 彤，丁燕玲，黄 婷，何玉榆，谭 磊*

(1.深圳市质量安全检验检测研究院，广东 深圳 518000；2.广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，广东 深圳 518000)

近年来，随着人们生活水平的不断提高，牛奶的销量也不断增加，能为人类提供蛋白质、维生素和钙等营养物质。玉米赤霉醇是人工合成的非类固醇同化性激素，曾被官方批准用于畜牧业生产[1]，用来提高畜禽的饲料转化率[2]，促进它们的生长[3]。然而，农产品在生长期间，饲料和农产品在加工、贮藏、运输过程中，均易造成玉米赤霉醇类药物污染。当给奶牛饲喂受到污染的饲料时，饲料中的玉米赤霉醇等可通过血-乳屏障进入到牛奶中，导致食用牛奶含有玉米赤霉醇类药物，并通过食物链在人体内蓄积，影响和破坏人畜的生长发育及生殖系统等。这不仅会给畜牧业及养殖业造成严重的经济损失，也会对食品安全构成严重威胁，因此已成为各地政府关注的问题。20 世纪80 年代左右，毒理学研究表明，这类药物会引发癌症。为了防止这些激素随畜产品进入人体，各国陆续颁布法令，禁止在畜牧业生产过程中使用。中华人民共和国农业农村部第250 号公告明确规定，在食品生产动物的饲养中禁止使用玉米赤霉醇，所产出的所有可食用动物产品不得检出[4]。

为有效监督牛奶质量安全，建立一种快速、可靠、准确、灵敏的玉米赤霉醇残留量的分析方法具有重要意义。目前，玉米赤霉醇类药物的测定方法有薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)[5]、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunoassay，ELISA)[6]、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)[7]、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)[8]和液相色谱-串联质谱法(liquid chromagraphy-mass spectrometry，LC-MS/MS) 等[9-11]，虽然相关文献已报道可用LCMS/MS 测定牛奶中的玉米赤霉醇，但是大多数检测方法存在操作复杂、提取效果差、回收率低的缺点。

本方法优化并建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法来检测牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的残留量。该方法简便可靠、灵敏度好、准确度高，无需经过净化可直接上机测定，有效解决了传统标准方法，例如，GB/T 23218-2008 中前处理过程繁琐[12]，易挥发性无水乙醚作为提取试剂具有提取分离效果差、对操作人员身体健康造成较大危害的缺陷，从而为食品安全和人们身体健康提供保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Aglient 1290 超高效液相色谱仪、配有电喷雾(ESI) 离子源的AB Sciex Triple QuadTM5500 质谱仪(美国AB Sciex 公司)、N-EVAP-24 型全自动氮吹仪、IKA 旋涡混合器、梅特勒PL602E 型天平、Sigma 3-30KS 离心机、Milli-Q Integral 3 型超纯水仪、奥特赛斯AS 系列超声波清洗机、CEM PHOENIX 微波马弗炉。

1.1.2 药品与试剂

乙腈(色谱纯)、无水硫酸钠(分析纯，使用前需540 ℃烘干8 h)等。

α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇：纯度高于90.0%，均为德国Dr.Ehrenstorfer 公司产品。

1.2 样本制备

取代表性样本约500 g，混匀，装入洁净容器，密封，标记。在抽样及制备的操作过程中，应防止样本收到污染或发生残留物含量的变化。并将试样于0 ℃～4 ℃保存。

1.3 标准储备液和混合标准工作液的配制

准确称取α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的标准品，分别用乙腈溶解并稀释成浓度为1.00 mg/mL 的标准储备液，－ 18 ℃以下冷冻避光保存6 个月。再分别移取适量上述各物质标准储备液，用乙腈逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.4 样本前处理

准确称取牛奶样本2.0 g±0.02 g 于 50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈后立即涡旋摇匀，再加入4 g 无水硫酸钠，涡旋混匀4 min，超声提取10 min，4 ℃ 9 000 r/min离心8 min，吸取上清液，氮吹近干，用1.00 mL乙腈复溶，过0.22 μm 有机相滤膜后，可直接上机测定。

1.5 UPLC-MS/MS 条件

1.5.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18(1.7 μm，3.0 mm×100 mm)；流动相A 为纯水；流动相B 为乙腈(色谱纯)；柱温40.0 ℃；进样体积5.00 μL。具体梯度洗脱程序见表1。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(multiplereaction monitoring，MRM)；电喷雾电压：－4.5 kV；离子源温度：500 ℃；气帘气压力：35.0 psi；碰撞气压力：9 psi；雾化器压力：55.0 psi；辅助加热器压力：55.0 psi。

保留时间、定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞能量见表2。

空白基质分别添加10.0 μg/kg α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的色谱图见图1。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

准确称取5 个牛奶空白基质样本，按“1.4 样本前处理”的方法处理，获得空白样本提取液。将空白样本基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液(质量浓度依次为：1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL)。按方法条件设置仪器参数，待仪器稳定后供超高效液相色谱-串联质谱仪测定，并绘制标准工作曲线。可发现基质试验峰面积与相应回收浓度的线性关系好，其中α-玉米赤霉醇的相关系数为r＝0.999 5，β-玉米赤霉醇的相关系数为r＝0.999 5，具体见表3。

2.2 方法检出限确定

以空白牛奶样本为基质，做七个平行添加试验，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的阳性添加浓度均为1.00 μg/kg，按照1.4进行前处理，进行上机测定。根据各样本检测值计算出平均值X 及标准偏差Sb，按公式检出限(MDL)=(k×Sb×C)/X(k为置信因子，一般取3；C 为理论加标水平，单位为μg/kg)计算，测得α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的方法检出限分别为9.22×10-2μg/kg、6.28×10-2μg/kg，见表3。

2.3 方法回收率和精密度验证

用空白牛奶基质样本分别对α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇进行3 个不同浓度水平的添加回收实验，每个水平均取6 个平行样，阳性添加浓度分别为1.00 μg/kg、2.00μg/kg、10.0 μg/kg。按“1.4 样本前处理”的方法进行处理，处理好的样本供超高效液相色谱串联质谱测定。牛奶样本中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的平均回收率和相对标准偏差结果详见表4。

由表4 可知，该方法的回收率较好，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的回收率分别为81.5 %～105.0 %、86.7%～97.0%，相对标准偏差均小于7.0%，说明该方法重复性好、定性、定量准确，并且峰形受基质的干扰比较小。

3 结论

本方法旨在建立一种牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的超高效液相色谱-串联质谱简便测定方法，为相关监管部门监管快速、准确测定牛奶中该类药物提供方法参考和技术支持。试验结果表明，该方法可以在很大限度上减少样本前处理时间，方法灵敏度及准确度高，提取分离度好。与传统的方法相比，该方法采用乙腈直接提取的方式极大限度提高了检测效率，可适用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇残留量的定性、定量检测。