基于网络药理学研究苏合香冰片配伍对急性心肌梗死的作用机制

付尹，王立映，王建，杨显娟，王佳俊

(成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137)

缺血性心脏病最常见的诱因是冠状动脉硬化引起的冠状动脉狭窄和梗死，约占总发生率的90%，从死亡数据变化看来，缺血性心脏病增长了约40.1%，其死亡率占总死亡的17.8%，是中国第二大主要致死原因[1]。心肌梗死是一种发病急，严重程度大的疾病，因其高发病率、高死亡率和高复发率，为患者、家庭及社会带来沉重的负担，严重威胁人类健康和生命安全。目前再灌注治疗使死亡率明显下降，但其带来的损伤仍需药物治疗，遑论世界范围内有相当多的心梗患者未接受任何形式的再灌注治疗[2]。几千年来，华夏民族在与疾病抗争的过程中，对于中医药的使用积累了丰富的经验，发现中医药对于心血管病的治疗卓有成效，其中便有芳香行气开窍之法。

芳香开窍药是指具有辛香走窜之性，以开窍醒神为主要功能的一类中药，苏合香和冰片为此类药物代表，二者均味辛，归心、脾经，具有开窍、止痛的功效，皆可用于治疗胸痹心痛[3]。通过梳理发现苏合香丸、苏冰滴丸、冠心苏合丸、安康心宝丸和心舒丸均含“苏合香-冰片”药对，但仅苏合香丸多用于寒闭证，其余药物多用于冠心病、心绞痛。心肌梗死的危害性较大而研究“苏合香-冰片”对心肌梗死的保护作用及机制相对较少，本研究将探索“苏合香-冰片”治疗急性心肌梗死的潜在靶点及相关作用机制。鉴于中药多成分、多靶点的特性，将运用网络药理学挖掘各中药成分和疾病靶点，预测“苏合香-冰片”在治疗急性心肌梗死方面的有效成分、作用靶点，构建“药物-有效成分-靶点”网络，根据参数筛选出关键作用靶点，对其进行生物信息学分析，为后期深入研究“苏合香-冰片”治疗急性心肌梗死的药理作用机制提供参考。

1 材料

中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，有机小分子生物活性数据库(Pubchem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/)，Swiss Target Predictions数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，NIMNT数据库(http://www.idrug.net.cn/NIMNT/)，GeneCards(www.genecards.org)数据库，DisGeNET(https://www.disgenet.org/)数据库，DigSee(http://210.107.182.61/geneSearch/)数据库，在线作图平台微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)，网络绘图软件Cytoscape 3.7.2，Metascape数据库(https://metascape.org/)。

2 方法

2.1 “苏合香-冰片”有效成分的筛选

运用TCMSP数据库分别检索关键词“苏合香”和“冰片”，保存各成分的Pubchem ID或CAS号。在Pubchem数据库中分别检索各成分的Pubchem ID或CAS号，下载其2D结构保存为SDF格式。上传至SwissADME数据库，根据胃肠道吸收(GI Absorption)、类药性(Druglikeness)筛选活性成分。

2.2 “苏合香-冰片”有效成分的靶点预测

运用Swiss Target Predictions数据库反向药效团匹配方法预测各活性成分的潜在靶点，下载保存预测结果，并根据Uniprot数据库将靶点名称标准化。

2.3 “苏合香-冰片”的适应症预测

运用NIMNT数据库对“苏合香-冰片”的全部靶点进行分析，预测该药对可能的适应症。

2.4 急性心肌梗死的靶点预测

运用GeneCards，DisGeNET和数据库分别检索关键词“acute myocardial infarction”进行急性心肌梗死的靶点预测，下载保存预测结果，并根据Uniprot数据库将靶点名称标准化。

2.5 “药物-有效成分-靶点”网络构建及重要靶点筛选

运用在线作图平台微生信对有效成分靶点与疾病靶点取交集，绘制韦恩图，得到“苏合香-冰片”与急性心肌梗死的共同作用靶点，即“苏合香-冰片”对急性心肌梗死的作用靶点。

通过网络绘图软件Cytoscape 3.7.2对获得的交集靶点与有效成分、药物构建网络，使它们的相互作用关系可视化。进一步使用Network Analyzer插件分析网络中每个节点的拓扑参数(Degree,Betweenness Centrality与Closeness Centrality)，选择拓扑参数Degree值大于所有点中位数均值的2倍，Betweenness Centrality与Closeness Centrality值大于所有点中位数均值的1倍的靶点作为重要靶点。

2.6 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

运用Metascape数据库对“苏合香-冰片”治疗急性心肌梗死的潜在靶点进行基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，用以说明相关靶点在基因功能和信号通路中的作用。GO功能富集分析主要包括生物过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和细胞组成(Cellular Component，CC)。通过在线作图平台微生信对富集分析结果进行可视化处理。

3 结果

3.1 “苏合香-冰片”有效成分筛选

TCMSP数据库中检索得到苏合香和冰片成分分别为48个和31个，其中经SwissADME筛选得到有效成分分别为26个和13个，经过核对可知苏合香与冰片有一个共同有效成分，结果见表1。

表1 冰片、苏合香有效成分

3.2 “苏合香-冰片”适应症预测

将3.1得到的有效成分用Swiss Target Prediction进行靶点预测，得到苏合香和冰片有效成分靶点分别为385个和299个，经Uniprot数据库标准化和去重后得到“苏合香-冰片”靶点为461个，随后将其导入NIMNT数据库，进行适应症分析，结果下载保存为tsv格式，打开结果文件，根据q<0.001进行筛选并按从小到大排序，得到371个可能适应症，排在前20位的可能适应症见图1，主要包括阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease)、冠状动脉疾病(Coronary Artery Disease)、心肌梗死(Myocardial Infarction)、动脉硬化(Atherosclerosis)、营养性疾病(Nutrition Disease)和肥胖(Obesity)。

3.3 “药物-有效成分-靶点”网络

通过GeneCards，DisGeNET和DigSee检索得到与急性心肌梗死有关的靶点分别为3 080个，766个和1 200个，将三个数据库的检索结果经Uniprot数据库标准化后映射取交集，得到急性心肌梗死的关键靶点共292个。将“苏合香-冰片”的去重后的唯一靶点与急性心肌梗死的关键靶点映射取交集，得到“苏合香-冰片”治疗急性心肌梗死的潜在靶点共69个，见图2。经过核对可知，“苏合香-冰片”的37个有效成分有对应的共有靶点，故针对37个有效成分和69个潜在靶点运用Cytoscape 3.7.2绘制出药物-有效成分-靶点的网络图。

经分析，网络中每个点的拓扑参数Degree，Betweenness Centrality与Closeness Centrality结果分别为：4、0.003 544 4、0.429 718 88，选择拓扑参数分别大于8、0.003 544 4、0.429 718 88的靶点作为重要靶点。结果筛选出7个“苏合香-冰片”与急性心肌梗死相同的重要靶点，分别为CYP19A1、ESR1、ESR2、CYP11B2、SLC6A4、SLC6A2及TLR4，将重要靶点及其相关的有效成分提取出来，得到“药物-有效成分-重要靶点”网络图，直观反映了它们之间的相互作用，见图3，拓扑参数分析见表2，其中包含41个节点，115条边，红色八边形代表急性心肌梗死疾病，墨绿色正方形代表药物，绿色菱形代表苏合香的有效成分，粉红色三角形代表冰片的有效成分，浅绿色六边形代表苏合香和冰片共有成分，黄色圆形代表三者共同靶点，橙色圆形代表苏合香与急性心肌梗死共有靶点。分别计算各节点的Degree值(一个节点与其它节点的连线越多，即相互作用关系越多，Degree值越大)，使其颜色、大小按照Degree值显示，进而表示各节点的重要程度。

图1 “苏合香-冰片”适应症预测图2 “苏合香-冰片”治疗急性心肌梗死的靶点

图3 重要靶点筛选及“药物-有效成分-重要靶点”网络图

表2 重要靶点及其拓扑参数分析

3.4 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

将“苏合香-冰片”治疗急性心肌梗死的潜在靶点导入Metascape数据库，下载分析结果保存为csv格式，打开结果文件，运用POWER函数将Log(q-value)值转化为q值，根据q<0.001进行筛选并按从小到大进行排序，分别选择前20条进行可视化，见图4、5。结果显示：与生物过程有关的条目共555个，主要参与血液循环、对氧化应激的反应、调节细胞死亡以及对活性氧的反应等方面；与细胞组成有关的条目共6个，主要参与构成生物膜；与分子功能有关的条目共30个，主要与酶的活性和血红素结合等相关；与109条KEGG通路有关，主要涉及肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinases,PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,Akt)信号通路、雌激素信号通路、低氧诱导因子-1(Hypoxia-Inducible Factor-1,HIF-1)信号通路、TOLL样受体(Toll-Like Receptors,TLR)信号通路以及血管内皮生长因子(Vascular Endothelia Growth Factor,VEGF)信号通路。药物有效成份与潜在靶点、潜在通路的相互作用关系见图6。

图4 GO功能富集分析

图5 KEGG通路富集分析

图6 “药物-有效成分-潜在靶点-潜在通路”网络图

4 讨论

苏合香、冰片为开窍药之代表，2020版《中国药典》记载二者均味辛，归心、脾经，具有开窍、止痛的功效，皆可用于治疗胸痹心痛。历代文献也不乏对苏合香和冰片的记载，如：《本经逢原》载苏合香“能透诸窍脏，辟一切不正之气”，《玉楸药解》载苏合香能“治气积血症，调和脏腑”，《本经便读》载冰片能“治诸中内闭”，《本草正》认为冰片“通窍，辟恶，逐心腹邪气”。目前临床使用的含有“苏合香-冰片”的复方，如苏合香丸、通窍镇痛散、麝香保心丸、冠心苏合丸、苏冰滴丸等更是种类繁多，各方药效及主治见表3，其中苏合香丸治“卒得心痛”，为芳香温通法治疗心血管疾病的代表方之一；麝香保心丸作为治疗冠心病心绞痛的主要药物，通过抑制心室重构、改善内皮功能、改善血流动力学指标、促血管新生、抑制炎症因子、缩小动脉硬化斑块、抗心肌纤维化、修复心肌损伤、抗心肌氧化、扩张冠脉等多途径发挥治疗作用[4]；对冠心苏合丸进行拆方研究表明，仅苏合香和冰片具有增加冠窦血流量、减慢心率及降低心肌耗氧量的作用[5]；苏冰滴丸对于游泳应激及垂体后叶素所致小鼠心肌缺血性超微结构改变有明显的保护效果，并能对抗垂体后叶素所致心肌营养性血溶量的降低，对抗去甲肾上腺素所致的主动脉收缩[6]。由此可见，“冰片-苏合香”在治疗心肌缺血/梗死疾病中发挥着重要作用。课题组前期研究也表明，苏合香防治给药可以减轻心肌梗死大鼠的心肌细胞病理性损伤，保护心肌发挥抗心肌缺血作用[7]；冰片可改善急性心肌梗死大鼠ST段和心功能，降低心脏脏器系数比和心肌梗死率，改善心肌组织病理性损伤，通过抑制血清心肌酶升高从而发挥心肌保护作用[8]。然而目前对于“苏合香-冰片”防治心肌缺血性疾病的研究及作用机制仍较少，故本研究基于网络药理学，通过多个数据库得到“苏合香-冰片”和急性心肌梗死的共同靶点，预测“苏合香-冰片”对急性心肌梗死的作用机制。

表3 含有“苏合香-冰片”的部分复方

网络药理学是基于系统生物学，通过筛选药物有效成分，收集有效成分和疾病的靶点来构建相互作用的网络，从而预测药物对疾病的作用靶点，诠释药物作用机制，探索药物新的适应症的研究方法[9]。由于中药具有多成分、多靶点的特性，利用网络药理学预测中药作用机制可为后续实验研究提供重要的参考依据。

本研究经筛选得到“苏合香-冰片”部分有效成分：异氟醚、积雪草酸可分别通过介导PI3K/Akt信号通路恢复临床心脏搭桥手术后心肌供血，减轻疼痛[10]，激活核因子E2相关因子2(Subcellular Localization of Nuclear Factor E2-related Factor 2,Nrf2)诱导的抗氧化通路形成抑制自发性高血压大鼠心肌纤维化[11]；同时肉桂酸早已被证明对心肌缺血再灌注损伤有保护作用[12]，芳樟醇能够剂量依赖性地降低心肌梗死模型大鼠心律不齐的发生率[13]。

本研究通过预测得到“苏合香-冰片”对急性心肌梗死作用的相关信号通路多涉及细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、血管新生等方面，见表4。其中，PI3K/Akt信号通路的活化可通过调节血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞凋亡影响冠心病的发生发展过程[14～16]，同时Akt在VEGF 介导调节内皮细胞迁移和血管的生成中起着重要作用[17]，缺血缺氧条件下VEGF诱导的治疗性血管生成可以恢复心肌的血液供应,保持左室功能。课题组前期研究表明，苏合香能下调急性心肌梗死模型大鼠心肌组织PI3K、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylate-Protein Kinase B,p-Akt)、总Akt蛋白水平[7]。Li等[18]的研究表明，速效救心丸(含冰片)可通过增强PI3K/Akt/糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)信号通路的磷酸化来保护HL-1心肌细胞免受缺氧诱导的细胞凋亡，这都为预测结果提供参考。炎症往往伴随心脏疾病发生发展的整个阶段，p-Akt可促使核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB)抑制蛋白α磷酸化，进而与NF-κB解离，使其进入细胞核诱导众多炎症因子如：白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、TNF-α等的表达,引起炎症反应[19-22]。TLR在炎症和免疫反应中也起着重要作用，其中TLR4作为TLR家族中的重要成员,已被用作对心脑血管风险检测的标志物[23]，其髓系分化蛋白依赖性途径可使NF-κb易位进入细胞核诱导促炎因子(血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(Lectin Like Oxidized Lowdensity Lipoprotein Receptor-1,LOX-1)、TNF-α、血管细胞粘附因子-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1,VCAM-1)、细胞间粘附因子-1(Intercellular Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1)等)的产生,加重血管损伤和动脉粥样硬化斑块沉积[24～25]。李静等[26]的研究表明，抑制TLR4、NF-κB和IL-6在动脉粥样硬化模型大鼠腹主动脉的表达有利于稳定粥样斑块。心肌梗死伴随缺血缺氧反应，HIF1-α可通过激活VEGF和一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的转录促进血管新生和舒张；激活葡萄糖转运蛋白-1(Glucose Transporter-1,GLUT1)促使葡萄糖转运；激活乳酸脱氢酶A(Lactate Dehydrogenase A,LDHA)参与糖酵解途径；激活促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)诱导红细胞生成。HIF-1α/BCL2/腺病毒E1B 19kDa 结合蛋白3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa Protein-Interacting Protein 3,BNIP3)信号通路还参与氧糖剥夺/再灌注(Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)损伤诱导的大鼠H9C2细胞自噬[27]，抑制该通路能减轻冠心病炎症反应、内皮损伤，调节血脂平衡，减少心肌组织细胞凋亡[28]。临床上心脑缺血疾患往往同时并存[29]，二者病因病程也常有相似之处，心肌梗死及脑卒中皆可由动脉粥样硬化导致，课题组前期研究表明，苏合香、冰片皆可升高脑缺血模型大鼠血清中VEGF含量而促进微血管新生[30]。雌激素对绝经前妇女的心血管系统具有保护作用,在窗口期开始激素补充治疗,能降低心血管疾病发生的风险[31-32]。但由于目前鲜见“苏合香-冰片”通过雌激素信号通路抗心血管疾病的报道，故值得进一步探讨。本研究所预测的机制通路相互交织，充分体现了中医药应用的整体观，以及中药多成分，多靶点，协同作用的特点。

表4 “苏合香-冰片”对急性心肌梗死的相关信号通路预测

NIMNT疾病预测结果提示，苏合香冰片配伍不仅可用于心血管疾病，还可用于营养性疾病和肥胖等，为该药对在临床上的使用提供了新方向。

本次研究基于网络药理学探讨了苏合香冰片配伍对急性心肌梗死的作用机制及其可能的适应症，由于仅进行了初步的预测，后续还将结合具体实验进行验证，以进一步阐明作用机制，为临床精准使用苏合香冰片治疗急性心肌梗死类疾病提供参考。