SETD2在肾透明细胞癌中的表达及对患者预后的影响

胡庆庆，刘浩然，王建忠

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)为泌尿系第2大恶性肿瘤，发生率仅次于膀胱癌；肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)作为RCC中的最常见亚型[1]，占所有RCC病理类型的70%～80%。ccRCC早期较难发现，且对放化疗不敏感，对于晚期患者，多依赖于免疫治疗。然而，由于肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)存在高度异质性且适应性极强，常出现耐药现象，治疗效果不尽理想[2]。TME及其免疫细胞浸润情况对肿瘤进展影响极大[3-4]。组蛋白甲基化转移酶(histone methyltransferase，SETD2)在多种人类肿瘤中存在突变，其表达缺失可能与患者预后差显著相关；然而作为经典的免疫相关调节分子，SETD2表达缺失在ccRCC肿瘤组织免疫浸润方面的调节及进一步对患者预后的影响有待研究。

1 材料与方法

1.1 数据资料利用肿瘤基因组计划数据库(the cancer genome atlas，TCGA) 中ccRCC数据集分析基因表达、基因突变数据。从基因组数据共享(genomic data commons，GDC)数据门户网站下载肿瘤RNA-seq数据((https://portal.gdc.cancer.gov/)，系统性地获取33种类型肿瘤的SETD2表达谱mRNA表达数据。此外，该研究从TCGA数据库中下载了336例ccRCC患者的基因突变数据、转录组数据和临床数据，并利用R软件中的maftools软件包下载并可视化了ccRCC患者的体细胞突变。收集安徽医科大学第一附属医院2015—2017年50例接受根治性或部分肾切除术后病理确诊为ccRCC患者病理组织及其完整预后信息资料。

1.2 方法

1.2.1SETD2 mRNA检测及CD8+T细胞的测定 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法进行SETD2 mRNA检测。使用TRIzol提取肾癌组织的总RNA。逆转录合成为cDNA，-80 ℃保存。ABI7300定量PCR仪进行qRT-PCR扩增反应，反应体系：20 μl(SYBR Green核酸染料10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各0.8 μl，模板cDNA 2 μl，去离子水6 μl)。PCR循环条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、31 s，共40个循环。内参基因GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；目的基因SETD2上游引物序列：5′-TCCAACAGTCTATGGTGTGA-3′，下游引物序列：5′-TGAGCTGTGAAAATCTGTTG-3′。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.2.2免疫荧光检测SETD2、CD8+表达 肿瘤组织石蜡切片利用梯度乙醇脱蜡后行抗原修复，0.01 mol/L PBST漂洗后行2% BSA封闭30 min，而后在各标本上滴加SETD2和CD8+一抗孵育4 ℃过夜，PBST漂洗3次后再行荧光二抗显色。肿瘤组织切片免疫荧光染色后行共聚焦显微镜观察，比较在SETD2高、低表达两组样本中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的浸润差异。

1.3 数据分析为了进行可靠的免疫评分评估，该研究使用了R软件包immune deconv，其中集成了6种最新算法，包括TIMER、xCell、 MCP-counter、CIBERSORT、 EPIC 及quanTIseq，结果通过R软件v 4.0.3中的ggplot2和pheatmap进行呈现。用Kaplan-Meier分析及log-rank测试研究并比较了不同免疫浸润情况及对应SETD2突变与否与患者总生存期(overall survival，OS)、无进展生存期(progression free survival，PFS)、无病生存期(disease free survival，DFS)预后的关系。

1.4 统计学处理基因差异表达使用R软件v 4.0.3进行统计分析。对每种肿瘤类型及其配对的正常样本之间SETD2的差异表达数据进行log2转换。χ2检验检测不同人口学特征及临床特征组ccRCC患者的SETD2表达是否有差别，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SETD2在ccRCC中的表达与免疫细胞浸润的关联利用TIMER2对TCGA中33种肿瘤类型基因表达谱进行SETD2的表达分析，并绘制肿瘤组织和正常组织中SETD2基因的表达分布图，其中横轴代表不同肿瘤组织，纵轴代表该基因表达分布情况。与对照组相比，SETD2表达在ccRCC癌患者肿瘤组织中表达显著下调(图1A)。该实验利用TIMER2分析了SETD2在泛癌中对免疫浸润的影响，并绘制了SETD2在泛癌中的免疫相关性热图。结果显示SETD2表达水平与ccRCC肿瘤组织中的CD4+、CD8+、中性粒细胞、髓系树突状细胞、巨噬细胞及B细胞浸润呈显著正相关(图1B)。

图1 SETD2在泛癌中的表达及与免疫细胞浸润的相关性

2.2 SETD2基因突变分布及ccRCC中各免疫功能类基因的突变为进一步明确SETD2基因在ccRCC 组织中的突变情况，该实验从TCGA数据库530例ccRCC患者中，挑选了含有基因突变数据的336例ccRCC患者的基因表达谱，并绘制了其基因突变景观图，结果显示有266例ccRCC患者存在基因突变，位列前10的高频突变基因有VHL、PBRM1、TTN、SETD2、BAP1、MUC16、MTOR、KDM5C、HMCN1、DNAH9，其中 SETD2突变频率达12.5%，位列体细胞突变频率第4(图2)。

图2 ccRCC肿瘤队列体细胞景观显示各基因突变频率及SETD2基因突变分布

2.3 肿瘤组织免疫浸润程度对ccRCC患者预后的影响为了评估TCGA中ccRCC患者肿瘤组织免疫浸润程度，该实验首先利用ssGSEA结合162个免疫示例基因进行共识聚类并行亚组分析，得到高免疫浸润组(Group1，395例)和低免疫浸润组(Group2，135例)(图3A)，而后通过TIMER分析两组队列中肿瘤组织免疫细胞浸润程度，结果显示B细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、髓系树突状细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞均可较好地区分两组队列，再次验证队列的免疫浸润程度(图3B)。随后，分析比较高、低免疫浸润组ccRCC患者预后，发现在总体生存率、无病生存率、无进展生存率方面，高免疫浸润组患者的预后均优于低免疫浸润组(图3C～E)。

图3 肿瘤组织免疫浸润程度对ccRCC患者预后的影响

2.4 SETD2突变与ccRCC肿瘤组织免疫细胞浸润的相关性该研究通过基因突变景观分析了SETD2分别在高免疫浸润、低免疫浸润两组中的突变频率，在低免疫浸润患者中，SETD2基因突变频率高达10%，而在高免疫浸润样本中，SETD2基因突变频率达2%，即SETD2基因突变频率两组中存在明显差异，低免疫浸润(10%)vs高免疫浸润(2%)，提示SETD2可能在ccRCC患者中起调控免疫浸润的作用(图4)。

图4 ccRCC不同免疫浸润程度患者各基因突变频率及SETD2基因突变分布A：低免疫浸润组; B：高免疫浸润组

2.5 SETD2突变对免疫浸润的影响及患者预后上述结果表明SETD2的表达与ccRCC的免疫浸润相关，并且SETD2的表达也与肿瘤的良好预后有关。该研究进一步在高、低免疫浸润组内将患者分为SETD2突变型(Mut)组、野生型(WT)组，利用TIMER2分析4组免疫浸润评分。结果显示在高、低免疫浸润组内比较，SETD2突变组中各免疫细胞浸润程度均比野生型组低，差异有统计学意义(P<0.05)；此外，CD8+T细胞在SETD2突变组与野生型组的浸润程度差异最明显，且在高免疫浸润SETD2 WT组中免疫评分最高(图5A、B)。进一步分析比较4组患者的预后，发现高免疫浸润SETD2 WT组患者预后最好，差异有统计学意义(P<0.05)(图5C)。

图5 ccRCC患者高、低免疫浸润组中SETD2突变组及野生型组免疫浸润评分及患者预后

2.6 SETD2对ccRCC预后及免疫浸润的影响分别对该院50例ccRCC患者性别、年龄、Fuhrman分级及TMN分期进行统计，根据SETD2 mRNA表达中位水平，将患者分为SETD2高、低表达两组。结果表明SETD2表达水平与患者性别、年龄不相关，而与Fuhrman分级及TMN分期有显著相关，SETD2低表达组分级及分期级别更高(表1)。此外，比较两组患者预后，OS生存曲线显示，SETD2高表达组患者的总生存曲线相较于SETD2低表达组患者更佳(图6)。

表1 SETD2表达水平与患者性别、年龄、Fuhrman分级、TMN分期的相关性

图6 SETD2高、低表达组患者OS生存曲线与SETD2低表达组比较：**P<0.01

为了进一步验证数据库数据分析所得结果：SETD2突变可能降低ccRCC肿瘤组织免疫细胞浸润(以CD8+TIL最显著)从而使患者预后差，该研究利用免疫荧光检测患者ccRCC组织SETD2、CD8+表达位置及其强度。结果显示SETD2高表达组织中CD8+表达也显著增高(图7)，提示SETD2可能促进肿瘤组织中CD8+TIL细胞浸润，从而缓解患者预后。

图7 ccRCC组织中SETD2、CD8+免疫荧光表达与SETD2低表达组比较：*P<0.05

3 讨论

SETD2是包含核受体SET域 (NSD) 家族的关键成员，是迄今在人体组织中发现的唯一参与H3K36me3形成过程的分子[5-6]，相关学者在多种人类恶性肿瘤中都曾检测到SETD2发生突变或功能丧失，导致相应肿瘤组织蛋白甲基化、去甲基化和表观突变失衡，从而致使肿瘤发生及恶化[7-8]。在ccRCC中，有研究[9]表明SETD2在肿瘤组织突变率较高，且可能与患者的不良预后相关。然而，既往的报道[10]关于SETD2突变频率的高低不尽一致，SETD2突变影响ccRCC患者预后的具体调控机制也并不明确。该研究在ccRCC中针对SETD2突变对肿瘤组织免疫细胞浸润的调控最终影响患者预后的机制进行了初步探究。

对于晚期肾癌，由于化疗药物疗效差，免疫疗法已成为治疗的重要手段。然而近年来随着在临床的广泛应用，免疫治疗也出现了耐药现象，仅40%的患者对免疫治疗反应敏感。对于肾癌免疫微环境的探索仍有待突破。既往有研究[11-12]表明，肿瘤浸润免疫细胞(tumor-infiltrating immune cells, TIICs)是RCC预后的重要决定因素，肿瘤免疫浸润与临床预后密切相关。该研究表明在高免疫浸润组ccRCC患者中，SETD2的表达水平更高,且患者预后更好。验证了TIICs与ccRCC患者预后的相关性，且SETD2可能在此过程中发挥作用。为了探明SETD2对ccRCC免疫浸润的影响，分别将高、低免疫浸润组ccRCC患者分为SETD2野生型及突变型组，分析显示SETD2突变组中各免疫细胞浸润程度均比野生型组低，高免疫浸润SETD2 WT组患者预后最好；其中，CD8+T细胞在SETD2突变组与野生型组的浸润程度差异最明显，且在高免疫浸润SETD2 WT组中免疫评分最高。

传统观点认为在多数恶性肿瘤中，CD8+T细胞高浸润患者预后更好。然而，CD8+T细胞在ccRCC肿瘤组织中的浸润程度对患者预后的影响仍有争议。有研究[13]认为CD8+TIL高浸润ccRCC患者预后更好，也有观点[14]认为CD8+TIL高浸润患者预后更差。结合该院ccRCC患者资料，研究表明SETD2高表达提示更好的患者预后，且与CD8+TIL高浸润相关, 与通过TCGA数据库分析所得结论相互佐证。而报道称CD8+TIL高浸润ccRCC患者预后更差的相关学者研究[14]表明，ccRCC肿瘤组织中浸润的部分CD8+T细胞会出现CXCL13这一趋化因子的表达，若CXCL13与CD8+蛋白双阳性T细胞这一亚群高表达，即会出现免疫逃逸，从而导致CD8+TIL高浸润ccRCC患者预后反而更差。

综上所述，该研究结果揭示了ccRCC中SETD2高表达及肿瘤组织CD8+T细胞高浸润均是患者的良好预后的指标，且SETD2高表达时，CD8+TIL高浸润对患者预后产生的积极作用更明显。然而，SETD2高表达是通过何种下游分子来促进CD8+T细胞发挥肿瘤杀伤作用，如何与CD8+T细胞表面免疫检查点相互作用来达到对ccRCC发展更好的控制作用的具体通路仍有待进一步探究。