丁香挥发油对水产品中易腐细菌抑制作用的影响

◎ 张思琪，韦邹萍，邵俊楠，许泽鹏，吴明霞，薛 斌

（广州工商学院 工学院，广东 广州 510850）

水产品因其独特的口感和丰富的营养成分受到消费者的喜爱。据统计，我国2021年水产品产量总计6 693万t，比2020年增长2.2%[1]。微生物的生长繁殖和食品内固有酶的活动是导致水产品腐败变质的主要原因。为满足消费者对水产品的需求，延长水产品货架期并保持其品质是水产品市场急需解决的问题。水产品的保鲜办法主要包括低温保鲜、化学保鲜剂保鲜与天然保鲜剂保鲜。其中，天然保鲜剂具有天然安全、高效低毒等特点，是近几年的热门保鲜技术。

丁香为丁香属落叶灌木或小乔木，主产于马达加斯加、印度尼西亚、印度及中国的海南省和云南省[2]。丁香是药食同源植物，丁香挥发油具有抗炎、麻醉、抗细菌、抗真菌、抗氧化和抗癌等功效[3]。研究表明，丁香挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和副溶血性弧菌等病原菌有较显著的抑制作用，但对水产品中易腐细菌抑菌作用的研究报道较少。本文以基围虾为实验试材，研究丁香挥发油对基围虾表面易腐细菌的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

基围虾（平均质量30～40 g），产于广东沿海，将购买后的基围虾迅速运送至实验室，置于-4 ℃冰箱中冷冻贮藏；丁香，产于云南，常温贮存；营养琼脂（蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉膏粉3 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH调至7.3±0.2）。

1.2 仪器与设备

冰箱，美的集团有限公司；电子天平，沈阳多杰电子科技有限公司；电子万用炉，天津市泰斯特仪器有限公司；洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外分光光度计，翱艺仪器上海有限公司；压力蒸汽灭菌锅，江明滨江医疗设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 丁香抑菌成分的提取

称取丁香2 g，置于1 000 mL的烧瓶中，加入适量的蒸馏水，使用玻璃棒上下搅动样品数次，使样品完全浸湿，并用标签标记好样品。用油性笔在烧杯上画出横线以记录水位，把烧杯放于电子万用炉上加热，水沸腾后开始倒计时，沸腾一段时间后关闭电子万用炉，期间须不时搅动样品，并保证水位基本与标记横线平齐。关闭电子万用炉后，待提取液冷却至室温。把120目滤网对折成两层置于漏斗上，借助玻璃棒直接将提取液过滤于容量瓶中，并定容至500 mL，得到丁香提取物[4]。

1.3.2 丁香抑菌成分提取工艺的优化

称取丁香2 g，进行单因素实验，研究料液比（1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85和1∶90）、提取时间（5 min、10 min、15 min、20 min和25 min）对水提法提取丁香中挥发油提取率的影响。按照1.3.1提取步骤提取[5]。

1.3.3 丁香提取物的抑菌实验

（1）预处理。在无菌操作环境下，将基围虾放在0.9%生理盐水中浸泡15 min制得菌悬液，以10倍、102倍、103倍、104倍和105倍稀释进行接种。根据预实验结果以稀释103的菌悬液作为最终接种样品浓度。

（2）抑菌实验。抑菌实验采用稀释涂布平板法测定菌落总数鉴定抑菌效果。将基围虾分成两组，以稀释103的菌悬液与丁香提取物1∶1混合作为阳性对照，以稀释103的菌悬液作为阴性对照，每组设置3个平行组进行抑菌实验。将接种完的培养皿正置于37 ℃恒温培养箱培养24 h后测定菌落总数并分析其抑菌效果。将所获得的的阴性组菌落用于微生物菌落分析。

（3）混合菌检测。从虾表面微生物的菌落提取基因组DNA，提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina Novaseq 6000进行测序[6]。高通量测序（如Illumina Novaseq等测序平台）得到的原始图像数据文件，经碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads）。实验原理如图1。

图1 实验原理图

（4）信息分析结果。数据通过质量过滤对引物序列进行识别阈去除得到不包含引物序列的Clean Reads，利用双端序列拼接对每个样品的Clean Reads进行拼接，根据不同区域的长度范围对拼接后数据进行长度过滤，最终使用去除嵌合体法得到最终有效数据。通过划分Feature（OTUs、ASVs）、多样性分析、差异分析、相关性分析及功能预测，统计与分析处理各阶段样品序列得出最终样品菌落丰富度图，以SILVA为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释[7]。

2 结果与分析

2.1 测定波长的确定

由图2可知，随着波长的增加，丁香的吸光值有着不同程度的变化，其中丁香的吸光值在340 nm处达到顶峰，由此可得丁香提取物在340 nm波长处的灵敏度最高，可提高实验的准确性。

图2 丁香提取物不同波长的吸收峰图

2.2 提取时间对丁香挥发油提取率的影响

图3为提取温度100 ℃、料液比1∶50的条件下，不同提取时间对丁香挥发油提取率的影响。随着提取时间的增加，丁香挥发油提取率逐渐升高。当提取时间为15 min时提取率趋于稳定。因此，提取时间为15 min最佳。

图3 提取时间对丁香挥发油提取率的影响图

2.3 料液比对丁香挥发油提取率的影响

图4为提取温度100 ℃，提取时间15 min条件下，不同料液比对丁香挥发油提取率的影响。料液比为1∶75时提取率最高。在沸水提取的条件下，提取溶剂量越大，渗透速度和化学成分溶解速率越快，提取率越高。当溶剂达到一定量时，浸出化学物质趋近饱和。综合考虑成本与环境因素，选择料液比1∶75、提取时间15 min、提取温度100 ℃的条件进行丁香挥发油的提取。

图4 料液比对丁香挥发油提取率的影响图

2.4 丁香提取物的抑菌效果

从基围虾菌悬液得到的细菌与添加丁香挥发油的菌悬液在营养琼脂培养板上进行稀释涂布培养18 h。由图5可知，丁香挥发油对基围虾表面的易腐细菌具有良好的抑菌效果。由图6可知，对照组菌液总数分别为 3.9×105CFU·mL-1和 4×105CFU·mL-1，实验组 a的菌落总数为1.3×105CFU·mL-1，实验组b的菌落总数为1.8×105CFU·mL-1。经丁香挥发油作用后，培养基中混合菌的菌落总数差异显著（P＜0.05），丁香挥发油对基围虾表面易腐细菌有显著的抑制作用。

图5 丁香提取物对混合菌的抑菌效果图

图6 丁香提取物对混合菌细菌总数的影响图

2.5 微生物分离鉴定

通过统计数据处理各阶段样品序列数目，评估数据质量。由表1可知，从样品中分离出10种微生物，其中变形菌纲微生物占样品中微生物的96.93%。根据碱基识别与国内外文献进行比对，结合SILVA数据库，将10种微生物鉴定到种的水平，如图7。

表1 混合菌菌类丰富度表

图7 混合菌菌类名称图

3 结论与讨论

研究发现，当丁香以1∶75料液比进行15 min的沸水提取，对基围虾表面易腐细菌有显著的抑制作用（P＜0.05）。水产品营养丰富，脂肪含量低，蛋白质含量高，易成为微生物天然的培养基。一些易腐微生物的生长是引起水产品腐败的主要原因。丁香作为一种具有抗炎、抗细菌、抗真菌的食药同源植物，是研究开发天然保鲜剂的良好选择。丁香挥发油可能是作用于细菌的细胞膜，改变其通透性，使得细菌因细胞膜的完整性被破坏达到抑制细菌生长的作用，进而达到水产品的保鲜作用。本实验为丁香挥发油的提取以及其应用于食品的防腐保鲜提供了数据及理论参考。