荞麦籽粒中抗真菌蛋白的分离纯化及抗真菌活性研究

李静舒 贺东亮

摘    要：为了深入研究荞麦中抗真菌类蛋白质，选择荞麦品种‘晋荞2号’籽粒为试验材料，先经过筛、脱脂，然后利用缓冲液浸提、硫酸铵盐析提取籽粒中总蛋白，水浴锅中80 ℃下热处理去除杂蛋白，经过Resourse S阳离子交换层析和Superdex Peptide HR10/300分子筛层析两步分离纯化，建立了一套荞麦抗真菌蛋白分离纯化的工艺。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定该抗真菌蛋白的相对分子质量，牛津杯法测定抑菌活性，倒置显微镜观察真菌形态变化。结果表明：试验获得的荞麦籽粒抗真菌蛋白在蛋白胶图上表现出单一条带，纯度较高，相对分子质量为8.2 kDa。该抗真菌蛋白对绿色木霉的生长有明显的抑制作用，并且呈现一定的剂量依赖性。形态学观察发现，菌丝生长受到抑制，表现出顶端部膨大、泡状物出现、原生质凝缩及片段化等特征。

关键词：荞麦;抗真菌蛋白;离子交换层析;分子筛层析;抗真菌活性

中图分类号：S517;Q516         文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.06.002

Purification and Antibacterial Activity of  Antifungal Protein from Buckwheat Seed

LI Jingshu1，HE Dongliang2

（1.Shanxi Open University，Taiyuan，Shanxi 030027， China; 2.Taiyuan Institute of Technology， Taiyuan，Shanxi 030008， China）

Abstract：In order to further study the antifungal proteins in buckwheat， the seed of 'Jinqiao 2' of buckwheat varieties was selected as the experimental material. After screening and degreasing， the total protein in the seeds was extracted by buffer solution extraction and ammonium sulfate salting out. The miscellaneous protein was removed by heat treatment at 80 ℃ in a water bath pot.After cationicex changing chromatography by Resource S and molecular sieve chromatography by Superdex Peptide HR10/300， a set of separating and purifying technology of buckwheat antifungal protein were set up.  The relative molecular mass of the antifungalprotein was determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis， the antifungal activity was determined by Oxford cup method， and the morphological changes of fungi were observed by inverted microscope. The results showed that the antifungal protein of buckwheat seeds showed a single band on the protein gel map and possessing high purity， and the relative molecular mass was 8.2 kDa. The antifungal protein significantly inhibited the growth of Trichoderma viride and showed a certain dosedependence.Morphological observation showed that the growth of mycelium was inhibited， showing the characteristics of top enlargement， vesicles， protoplasm condensation and the morphological fragmentation.

Key words： buckwheat;antifungal protein;cationic exchange chromatography; molecular sieve chromatography; antifungal activity

高等植物在其種子贮藏、植株形成等生长阶段，会受到各种病原微生物污染的影响。但是经过长期的进化，高等植物也形成了一套自己的防御体系，来维持植物抗病性和病原微生物致病性的动态平衡。最常见的方式是在植物体内表达出具有抵抗病原微生物的物质，例如抗菌蛋白（antimicrobial protein，AMPs），它是某些植物体为了抵抗外界病原体的侵袭，而产生的一种或一类具有抗菌活性的非特异性蛋白质的总称[1-2]。植物源的抗菌蛋白具有其独特的优越性，它们的抗菌活性较强，抗菌谱范围广，可以直接作为杀菌制剂喷涂在植株上或混入植物生长的土壤中，因而受到研究人员的广泛关注。有报道称，在多种植物中发现并分离出抗菌蛋白，它们对细菌、真菌和某些病毒的生长活性具有明显的抑制作用。袁素素等[3]从望江南种子中提取出SU5抗菌蛋白，该蛋白对玉米小癍病菌等12种植物病原真菌具有抑制活性。张耀等[4]从芝麻菜种子中分离纯化出ZSU2抗菌蛋白，且该蛋白具有极强的热稳定性和酸碱稳定性。另外，植物源抗菌蛋白还可以作为基因工程改造的材料，经过修饰、加工，将抗病基因导入植株中，进一步提高植物的抗病能力。肖松华等[5]将天麻抗真菌蛋白基因插入到一种棉花品系中，获得三种抗落叶型黄萎病的棉花株系。

荞麦，属于廖科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum），一年或多年生双子叶草本植物[6]。山西是荞麦主产区之一，品种资源丰富、种质优良。荞麦在全省各个地区均有种植，以晋北、晋西北以及丘陵山区最多[7]。山西省的荞麦品种主要有甜荞和苦荞。荞麦具有很高的营养价值，兼具食用和药用性[8-9]，富含蛋白质、维生素、矿物质以及多种功能性物质[10-11]。例如，生物类黄酮类化合物、酚类、蛋白酶抑制剂等，具有降糖、降脂、抗氧化和抗肿瘤等功效[12-15]。荞麦作为一种开发前景广泛的农作物，有关其抗菌蛋白的研究较少。本研究以一种荞麦籽粒为材料，提取总蛋白后，根据蛋白的电荷性质以及分子大小范围对其进行分离纯化，得到目的蛋白，对其相对分子质量和抗真菌活性进行研究，以期获得一种具有抗菌活性的蛋白质，为筛选植物源杀菌剂、农产品储藏、新型抗病植株研发提供一定的理论依据，同时有利于推动荞麦产业的健康发展，提升对小杂粮研究的科技创新能力。

1 材料和方法

1.1 试验材料

荞麦籽粒为当年种植收获的‘晋荞2号’，由山西省农业科学院提供;供试菌种为绿色木霉（Trichoderma virid），由山西大学生物技术研究所提供;其余试剂为国产分析纯。

1.2 试验仪器

Resource S离子交换层析柱、Superdex Peptide HR10/300排阻层析柱、AKTA explorer蛋白纯化仪均为GE Healthcare品牌;離心机为贝克曼公司生产;恒温水浴锅为上海森地科学仪器厂生产。

1.3 试验溶液与培养基

液1：浸提缓冲液（20 mmol·L-1 Tris-HCl，pH值为8.0）;

液2：Resource S阳离子交换层析平衡缓冲液（20 mmol·L-1 NH4Ac，pH值为4.5）;

液3：Resource S阳离子交换层析洗脱缓冲液（20 mmol·L-1 NH4Ac，200 mmol·L-1 NaCl，pH值为4.5）;

液4：分子筛层析平衡缓冲液（20 mmol·L-1 Tris-HCl， 150 mmol·L-1 NaCl，pH值为8.0）。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：取200 g马铃薯，加一定量水，料理机粉碎，煮沸30 min，静置冷却后，用厚纱布过滤，弃渣，在清液中加入葡萄糖20 g，定容至1 L，加入18 g琼脂，灭菌处理，备用。

1.4 试验方法

1.4.1 荞麦籽粒中总蛋白的提取及处理 荞麦籽粒：恒温烘箱中干燥→粉碎机粉碎→过筛处理，备用。

按照1∶3（g∶V）的比例加入丙酮，在4 ℃冰箱中搅拌脱脂3 h，减压抽滤后得到滤饼。向滤饼中加入一定量的乙醚，搅拌3 h后，减压抽滤得到滤饼。将滤饼低温干燥，制得荞麦籽粒的脱脂粉末。取该粉末20 g，加入200 mL液1，4 ℃冰箱中提取8 h后离心，保留上清液，加入硫酸铵，待完全溶解后离心，弃沉淀，向上清液中继续加入硫酸铵至80%饱和度，搅拌盐析8 h后离心，弃上清液保留沉淀。在沉淀中加入一定量的液1，溶解后进行搅拌透析，得到荞麦籽粒的水溶性总蛋白溶液。将该蛋白溶液置于80 ℃水浴锅中恒温处理20 min，以去除热稳定性差的杂蛋白，离心后保留上清液，备用。

1.4.2 目的蛋白纯化 将1.4.1制得的样品溶液，在AKTA purifier蛋白纯化仪上进行分离纯化。

将样品上样于用液2充分平衡过的Resource S阳离子交换层析柱，流速控制在0.5 mL·min-1，待穿透峰被完全洗脱后，再设置200 mmol·L-1 NaCl的连续梯度洗脱，收集各洗脱峰，根据牛津杯法测定各洗脱组分的抗真菌活性。

将具有抗真菌活性的Resource S阳离子交换层析洗脱组分，分别上样于Superdex Peptide HR 10/300分子筛层析柱，流速控制在0.5 mmol·L-1，收集各洗脱峰，根据牛津杯法测定各洗脱组分的抗真菌活性。

1.4.3 荞麦籽粒抗真菌蛋白的相对分子质量测定    采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定荞麦抗真菌蛋白的相对分子质量。配制浓度为5%的浓缩胶，浓度为15%的分离胶，考马斯亮蓝R-250染色，中分子量标准蛋白作为对照，GeneTools software软件分析目的蛋白纯度。

1.4.4 荞麦籽粒抗真菌蛋白的抗真菌活性测定    采用牛津杯法[16]。将供试菌种点植在PDA培养基中心，28 ℃下培养，待菌落直径生长至2 cm时，在距离菌落边缘的1 cm处放置牛津杯。以缓冲液作为对照组，不同浓度的样品为试验组，经过滤膜（0.22 μm）过滤除菌处理后，加入牛津杯中。于4 ℃下预先扩散24 h后，转移该培养基到培养箱（28 ℃），72 h后，观察菌丝生长情况。

1.4.5 真菌菌丝形态学观察 将1.4.4中培养基直接放置于倒置显微镜下，观察对照组和试验组作用后的真菌菌丝形态。

2 结果与分析

2.1 荞麦籽粒抗真菌蛋白纯化

2.1.1 荞麦籽粒抗真菌蛋白的离子交换层析 将热处理后的荞麦籽粒水溶性总蛋白样品，上样于Resource S 阳离子交换层析柱，设置200 mmol·L-1 NaCl的连续梯度洗脱，分离后得到6个蛋白洗脱峰（图1）。经过抗真菌活性测定，其中峰IV具有活性，收集峰IV进行下一步的凝胶过滤层析。

2.1.2 荞麦籽粒抗真菌蛋白的凝胶排阻层析 将Resource S阳离子交换层析中得到的洗脱峰IV上样于Superdex Peptide HR10/300凝胶排阻层析柱，得到4个蛋白洗脱峰（图2），同上述方法测定，峰D具有抗真菌活性，峰D即为目的蛋白。

2.2 荞麦籽粒抗真菌蛋白的相对分子质量测定

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定荞麦籽粒抗菌蛋白的相对分子质量。经过Resource S阳离子交换层析及Superdex Peptide HR10/300凝胶排阻层析分离，从荞麦籽粒中纯化得到一种抗真菌蛋白。由图3可以看出，该蛋白得到高度纯化，在蛋白胶图中表现出单一条带，达到电泳纯。以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，相对分子质量的对数为纵坐标，作标准曲线。根据标准曲线，得出该抗菌蛋白的相对分子质量约为8.2 kDa。

2.3 荞麦籽粒抗真菌蛋白的抗真菌活性分析

抗真菌试验结果（图4）表明，与对照组相比，荞麦籽粒抗真菌蛋白对绿色木霉生长具有明显的抑制作用，在其浓度分别为0.5，1 μg·mL-1时，可观察到在绿色木霉样品组有明显的抑菌圈，而且样品浓度越高，抑菌圈越大，表现出一定的剂量依赖性。此现象表明，目的蛋白对该菌株有显著的抑制作用。

为进一步观察荞麦籽粒抗真菌蛋白的抗菌作用，将对照组（缓冲液）和试验组1处理后的绿色木霉在倒置显微镜下进行形态学观察。结果表明，对照组的菌丝生长没有受到抑制，菌丝光滑均匀（图5-A），而试验组的菌丝生长受到抑制，出现停滞，菌丝顶端分支加剧（图5-C）。将菌丝在显微镜下放大一定倍数后，可观察到对照组的菌丝形态正常（图5-B），而试验组的菌丝顶端膨大，产生不规则泡状结构（图5-D），菌丝原生质凝缩，出现片段化结构（图5-E）。

3 结论与讨论

在农业生产和食品工业中，长期使用化学类农药或食品防腐剂，可能会造成农作物产生耐药性、污染环境和降低食品安全性等问题，对人类健康和环境可持续发展产生不利的影响。植物是抗菌活性物质的天然宝库，植物源抗菌蛋白来源范围较广，具有广谱性、安全性高、对环境友好的特点。在日常使用中，抗菌蛋白溶解性更高，易溶于水，利于发酵产品的提纯和精制，可提高产品纯度和质量。另外，抗菌蛋白的分子量小，具有更好的热稳定性和低致敏性，适用范围更广。

笔者以荞麦作为研究对象，通过丙酮浸提、硫酸铵盐析提取苦荞籽粒总蛋白。2次硫酸铵盐析沉淀蛋白，既能够除掉提取过程中的杂蛋白，又能最大限度地保留目的蛋白，保证了所得荞麦籽粒总蛋白的品质。抗菌蛋白研究的最大问题就是纯化，所以纯化手段通常会联合运用多种层析手段，本研究经过2步分离纯化，即阳离子交换层析和分子筛层析，最后获得纯度较高的荞麦籽粒抗真菌蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验证明，目的蛋白的相对分子质量为8.2 kDa。同时，抗真菌活性试验结果表明，该抗真菌蛋白对绿色木霉菌的生长有明显的抑制作用，并且呈现一定的剂量依赖性。形态学观察结果也证实，荞麦籽粒抗真菌蛋白导致绿色木霉的菌丝生长受到明显抑制。推测原因可能是抗菌蛋白具有一定的阳离子特性，破坏了真菌的细胞膜，细胞内容物渗出，细胞内外的渗透压发生改变，最终导致细胞发生衰亡。本研究建立的提取、纯化方法较为简单，产物纯度较高，但是在农业生产实践中，环境变化较大，要求植物源灭菌物质具有极强的耐热、耐冻、耐旱、耐酸碱等稳定性能，这还有待于开展更多的基础研究。

参考文献：

[1] A KAR， A KAR TK. Antimicrobial proteins and their importance in immunity[J]. Balkesr Health Sciences Journal， 2017， 6（2）： 82-86.

[2] BISHT A， THAPLIYAL M， SINGH A. Screening and isolation of antibacterial proteins/peptides from seeds of millets[J]. International Journal of Current Pharmaceutical Research， 2016， 8（3）： 96-99.

[3] 袁素素， 张玮玮， 王财成， 等. 望江南种子SU5抗菌蛋白的纯化、抑菌机制及稳定性研究[J]. 河南农业科学， 2019， 48（8）： 81-87.

[4] 张耀， 王财成， 袁素素， 等. 芝麻菜种子抗菌蛋白的纯化及其抗菌活性[J]. 食品工业科技， 2018， 39（20）： 92-97.

[5] 肖松华， 赵君， 刘剑光， 等. 转天麻抗真菌蛋白基因提高棉花对黄萎病抗性[J]. 作物学报， 2016， 42（2）： 212-221.

[6] 范昱， 丁梦琦， 张凯旋， 等. 荞麦种质资源概况[J]. 植物遗传资源学报， 2019， 20（4）： 813-828.

[7] 李秀莲， 赵建栋， 史兴海， 等. 山西荞麦科研简史[J]. 中国科技信息， 2018（13）： 106， 108.

[8] 林汝法. 中国荞麦[M]. 北京： 中国农业出版社， 1994： 356-357.

[9] 梁啸天， 张春华， 倪娜， 等. 荞麦营养功能与产品开发前景[J]. 特种经济动植物， 2020， 23（9）： 21-23， 32.

[10] 吴立根， 屈凌波， 王岸娜， 等. 荞麦营养功能特性及相关食品开发研究进展[J]. 粮油食品科技， 2018， 26（3）： 41-44.

[11] 侯振平， 郑霞， 陈青， 等. 金荞麦的营养价值、提取物生物活性及其在动物生产中的应用[J]. 动物营养学报， 2021， 33（6）： 3019-3027.

[12] 王菲， 李颖， 简天琪， 等. 黑苦荞麦黄酮的提取及体外抗氧化活性研究[J]. 应用化工， 2020， 49（11）： 2795-2799.

[13] 崔晓东， 范鑫， 闫红， 等. 荞麦蛋白酶抑制剂α-螺旋对抗肿瘤活性的影响[J]. 山西大学学报（自然科学版）， 2021， 44（4）： 815-823.

[14] 杜藝， 崔彤霞， 马文洁， 等. 荞麦黄酮通过下调lncRNA DLX6-AS1抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞炎症因子表达和纤维化[J]. 中国中西医结合肾病杂志， 2021， 22（1）： 37-40.

[15] 李红丽， 文丹丹， 周美亮， 等. 金荞麦抑瘤活性成份提取及作用机制研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学， 2019， 24（7）： 833-840.

[16] 周芳， 熊海涛， 张江， 等. 牛津杯法测定抗菌肽对四种有害微生物的抑制效果[J]. 饲料工业， 2018， 39（6）： 48-51.