安五脂素对α-黑色素细胞刺激素诱导的小鼠黑色素瘤B16F10细胞中黑色素生成的影响及机制

庄文越，苏小明，赵鸣瑶，李贺，王春梅，陈建光，李正祎，邱旭东，杜兴旭

（北华大学 1.医学技术学院，3.药学院，5.附属医院，吉林吉林 132013；2.吉林省肿瘤医院检验科，吉林长春 130000；4.吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013）

黑色素存在于皮肤、头发和眼睛中，决定皮肤颜色并保护机体免受紫外线损害，但若过度产生则可导致雀斑、黄褐斑和老年斑等［1］。近年来，中药提取物因具有高效、低成本和不良反应小等优点，越来越多地应用于美白化妆品之中［2-3］。

安五脂素（anwulignan）是五味子木脂素类成分中具有代表性的单体活性成分，具有抗细胞凋亡［4］、抗氧化［4-5］、抗疲劳［5-6］、抑制血小板聚集［7］和保肝［8］等作用，可通过调节核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor-2，Nrf-2）和P38 丝裂原活化蛋白激酶等信号通路参与抗氧化和抗炎等过程［8］。而黑色素的合成与氧化应激反应密切相关［9-10］，目前尚未见安五脂素影响黑色素生成的报道。因此，本研究以α-黑色素细胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）诱导的小鼠黑色素瘤B16F10 细胞为模型，研究其对黑色素生成的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、主要试剂和仪器

B16F10 细胞，中国科学院细胞库。安五脂素（纯度99.2%，批号：19073005），四川省维克奇生物科技有限公司。MTT，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；左旋多巴（levodopa，L-DOPA）、NaOH和Triton X-100，上海生物工程有限公司；α-MSH，美国Sigma 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠Nrf-2、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和β 肌动蛋白单抗（一抗）及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 多抗（二抗），武汉ABclonal 公司；RNA 提取试剂盒、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR 和2 x ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，美国Vazyme公司。全自动凝胶成像系统和Image J分析软件，上海天能科技有限公司。

1.2 MTT法检测B16F10细胞存活率

B16F10 细胞生长至对数生长期时，消化重悬，按照每孔5000 细胞（200 μL）加入96 孔板中。37℃，5% CO2培养箱培养，待细胞贴壁后，弃培养基，加入安五脂素0，1.25，2.5，5，10，20，40 和80 μmol·L-1。孵育48 h 后，加入MTT 溶液20 μL，4 h后弃上清，加入DMSO 150 μL，室温摇动10 min，490 nm 处测定吸光度值（A490nm）。每组设3 复孔，实验重复3 次。细胞存活率（%）=给药组A490nm/细胞对照组A490nm×100%。

1.3 细胞培养、分组和处理

取B16F10 细胞于25 cm2细胞培养瓶中，接种密度为1×109L-1。加5 mL 含10% 胎牛血清的DMEM 培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至约80%，用PBS 洗1 次，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶1 mL，于37℃细胞培养箱中消化2 min，按1∶2 比例传代。实验分为细胞对照组、α-MSH模型组和模型+安五脂素5，10和20 μmol·L-1组。细胞对照组加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，模型组加入α-MSH 300 nmol·L-1［11］，模型+安五脂素组同时加α-MSH 300 nmol·L-1和不同浓度安五脂素。每组设3复孔，培养48 h。

1.4 NaOH裂解法检测B16F10细胞黑色素含量

将细胞以1×108L-1接种于6孔板中，每孔2 mL培养24 h。按1.3 分组处理并收集细胞，加入含10% DMSO 的NaOH 1 mol·L-1溶液1 mL，80℃水浴1 h。取溶液200 μL 加入96 孔板中，测定A405nm。实验重复3次。

1.5 L-DOPA 氧化速率法测定B16F10 细胞酪氨酸酶活性

按1.3 处理细胞，用预冷的PBS 洗涤后加入1 mL 1% Triton X-100 裂解，快速置-80℃冰箱中30 min，室温下解冻约20 min。混匀后取100 μL于96 孔板中，加入100 μLL-DOPA 2 μmol·L-1混匀。37℃孵育1 h，测定A475nm。实验重复3次。

1.6 WST-1 法检测B16F10 细胞SOD 活性和MDA水平及化学荧光法检测ROS水平

按1.3 用安五脂素处理细胞，按试剂盒说明书操作，检测细胞SOD活性及MDA和ROS水平。

1.7 RT-qPCR检测B16F10细胞HO-1基因mRNA表达水平

按1.3 处理细胞48 h，据RNA 提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。测定A260nm和A280nm评价RNA质量。以RNA为模板，按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书进行实时定量逆转录PCR（real time-quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）。反应总体积20 μL，包括SYBR qPCR 混合液10 μL，引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，cDNA 1 μg，无RNA 酶水补充至20 μL。HO-1基因序列在NCBI 查找，用Primer premier 6.0 软件进行引物设计。β 肌动蛋白引物序列为上游：GGCTGTATTCCCCTCCATCG，下游：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT；HO-1引物序列为上游：TGACACCAAGGACCAGAG，下游：AAGGACCCATCGGAGAAG。条件为：95℃30 s，95℃10 s 和60℃30 s（40个循环），95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。制备熔解曲线，采用2-△△Ct表示HO-1mRNA相对表达水平。

1.8 Western印迹法检测Nrf-2和HO-1蛋白表达水平

取1.3 处理细胞，用PBS 洗涤2 次，用含1%苯甲磺酰氟和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液在冰浴条件裂解细胞60 min，4℃9419×g离心5 min，分离上清液获得总蛋白。用BCA 试剂盒进行蛋白质定量。用10%十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移至聚偏氟乙烯膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，并与一抗（抗HO-1 单抗：1∶1000；抗β 肌动蛋白单抗：1∶2000）孵育过夜。用含吐温-80的Tris缓冲液（TBS-T）洗涤，再与二抗（1∶10 000）室温孵育1 h；TBS-T洗涤，最后用增强型ECL显影液显色，用全自动凝胶成像系统采集蛋白条带，Image J分析其积分吸光度值。用目标蛋白与内参蛋白条带积分吸光度比值表示目标蛋白相对表达水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 安五脂素对B16F10细胞存活率的影响

如图1 所示，与细胞对照组相比，安五脂素浓度＜20 μmol·L-1对B16F10 细胞存活率无显著影响。因此选择安五脂素5，10 和20 μmol·L-1进行后续实验。

2.2 安五脂素对α-MSH 诱导的B16F10 细胞黑色素含量的影响

如图2 所示，与细胞对照组相比，模型组B16F10细胞黑色素含量显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+安五脂素5 μmol·L-1组细胞黑色素含量无明显变化，10和20 μmol·L-1组显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 安五脂素对α-MSH 诱导的B16F10细胞酪氨酸酶活性的影响

如图3所示，与细胞对照组相比，模型组酪氨酸酶活性显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+安五脂素10 和20 μmol·L-1组酪氨酸酶活性显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 安五脂素对α-MSH 诱导的B16F10 细胞SOD活性及MDA和ROS水平的影响

如图4 和图5 所示，与细胞对照组相比，模型组B16F10细胞SOD活性降低（P＜0.01），MDA和ROS水平升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+安五脂素3 个浓度组SOD 活性均升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA和ROS水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 安五脂素对α-MSH 诱导的B16F10 细胞Nrf-2蛋白及下游HO-1 mRNA和蛋白表达的影响

如图6A所示，与细胞对照组相比，模型组HO-1mRNA 表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，模型+安五脂素5，10 和20 μmol·L-1组HO-1mRNA表达水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。如图6B所示，与细胞对照组相比，模型组HO-1 和Nrf-2 蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，模型+安五脂素20 μmol·L-1组HO-1 蛋白表达水平明显增加（P＜0.01），模型+安五脂素5，10 和20 μmol·L-1组Nrf-2蛋白表达均明显增加（P＜0.01）。

3 讨论

α-MSH 作为促黑色素生产激素，可使B16F10细胞酪氨酸酶活性增强，黑色素生成增多。因此，选择合适浓度的α-MSH 可作为诱导剂刺激黑色素分泌，建立色素沉着模型以研究药物的美白作用［11-13］。本研究结果显示，安五脂素在浓度＜20 μmol·L-1时对细胞无明显毒性作用，故采用安五脂素5，10和20 μmol·L-1进行后续实验。

酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，因此阻断或抑制黑色素形成过程中酪氨酸酶活性即可有效抑制黑色素生成。本研究结果显示，B16F10 细胞经α-MSH诱导后，细胞黑色素含量和酪氨酸酶活性明显增加，表明α-MSH诱导的黑色素高表达细胞模型制备成功。安五脂素10 和20 μmol·L-1显著抑制α-MSH诱导的B16F10 酪氨酸酶活性，减少黑色素生成。

黑色素的生成过程受多方面调控，包括黑色素小体转运［14］、自噬［15］和氧化应激［12］等。据报道，在α-MSH 促进黑色素合成的同时，大量自由基可在L-3，4-二羟苯丙氨酸的氧化还原反应过程中生成［16］，且α-MSH 诱导黑色素生成与ROS 的产生有关［17］。SOD不仅能有效清除体内氧自由基，还可抑制酪氨酸酶的活性，通过清除超氧阴离子维持细胞氧化还原稳态，从而减少活性氧对细胞的损伤，具有减轻色素沉着的作用［18-19］。许多研究报道了多种抗氧化剂，如没食子酸［20］、姜黄素［21］和抗坏血酸［22］等具有抗黑色素生成的作用。本研究结果表明，安五脂素可抑制α-MSH 诱导的B16F10 细胞ROS 生成，降低MDA 水平，提高关键抗氧化酶SOD活性。

Nrf-2/HO-1 信号通路是主要抗氧化应激的通路之一，在抗ROS 生成和氧化应激中发挥重要作用。Nrf2 与其负性调节因子Keap1 解离后进入细胞核，上调其下游抗氧化基因HO-1的转录表达，维持体内氧化还原稳态［23］。已有研究报道，安五脂素具有抗炎和抗氧化作用，可有效激活Nrf-2 信号通路发挥抗氧化作用［5-6］。本研究结果表明，安五脂素能上调α-MSH 诱导的B16F10细胞Nrf2表达，且增加其下游HO-1表达。

上述结果表明，安五脂素可能通过抗氧化作用抑制黑色素合成，其机制亦可能与其抑制Nrf-2 信号通路有关。