牙髓干细胞来源胞外囊泡通过调节miR-100-5p抑制γ射线所致小鼠骨髓细胞FDC-P1凋亡

易静，陶宁，吕琳，刘超，张愉宁，段晗，王华

（1.安徽医科大学生命科学学院，安徽合肥 230032；2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850；3.暨南大学附属第一医院，广东广州 510630）

不同剂量的电离辐射可导致不同程度损伤［1］造血系统、胃肠道、肾、免疫系统、皮肤和肺等。与胃肠道系统等相比，骨髓造血细胞对辐射更为敏感，更易发生辐射损伤。亚致死剂量的电离辐射可引起骨髓抑制，造成患者血细胞功能和数量异常而产生免疫抑制；高剂量的电离辐射将导致骨髓衰竭，严重者导致死亡［2］。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）可改善辐射对骨髓和其他组织的损伤［3］。最近研究发现，来自MSC 的条件培养液或胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）在逆转组织损伤方面具有与MSC 类似的作用，如MSC 来源的EV 可修复辐射对骨髓造血细胞的损伤［4］。EV 是细胞释放出来的球形双层膜颗粒，能够选择性富集其亲本细胞中的蛋白质、脂质、DNA 和RNA 等物质，通过转移其内容物至特定靶细胞调节细胞的生物学功能，是新发现的一种高效的细胞间信号交流方式［5］。

牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSC）是一种牙髓组织来源的MSC，能沿典型的中胚层细胞谱系分化（如软骨、脂肪和成骨），可从脱落的智齿和乳牙、多生牙及阻生牙中获得，对供体几乎无损害［6-7］。与脐带来源的MSC 相比，DPSC 在成骨分化、免疫调节、抗凋亡和抗衰老方面具有显著优势，DPSC 来源的EV（DPSC-EV）具有广阔的临床应用前景。本研究通过60Co γ 射线单次照射小鼠骨髓FDC-P1 细胞，并在照射后给予DPSC-EV 干预，探讨γ 射线照射对小鼠骨髓细胞凋亡的影响及DPSC-EV对造血细胞辐射损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

小鼠骨髓细胞FDC-P1 和DPSC，购自国家生物医学实验细胞资源库，本实验室保存。RPMI 1640 培养基和α-MEM 培养基，美国Gbico 公司；胎牛血清，美国Sigma公司；白细胞介素3（interlukin-3，IL-3），美国PeproTech公司；细胞凋亡检测试剂盒，江苏凯基生物公司；RIPA 裂解液，上海碧云天公司；BCA 蛋白质定量检测试剂盒，美国Thermo 公司；兔抗小鼠胱天蛋白酶3（含胱天蛋白酶原和活化胱天蛋白酶）多抗和兔抗小鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（含活化PARP）多抗，美国CST 公司；兔抗人CD9 和CD73多抗（一抗），美国Abcam 公司；兔抗人β肌动蛋白（β-actin）多抗（一抗），美国Proteintech 公司；兔抗人β 微管蛋白（β-tubulin）多抗（一抗），武汉赛维尔公司；RNA 快速提取试剂盒，上海奕杉生物科技公司；微RNA（microRNA，miRNA）第一链cDNA合成（加尾法）和miRNA 实时荧光定量PCR（real time-quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）试剂盒（染料法）、小鼠miR-100-5p（mmumiR-100-5p）引物（上游：5'-CCCTAACCCGTAGATCCGAA-3'；下游：5'-GAGGAGGAAGAAGAGGAGGA-3'）、mmu-miR-100-5p 抑制剂（RNA oligo干粉）（5'-3'序列：（mC）（mA）（mC）（mA）（mA）（mG）（mU）（mU）（mC）（mG）（mG）（mA）（mU）（mC）（mU）（mA）（mC）（mG）（mG）（mG）（mU）（mU））和抑制剂对照（RNA oligo 干粉）（5'-3'序列：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA）、mmu -miR-100-5p 模拟物（RNA oligo 干粉）（正义链：5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'；反义链：5'-CAAGUUCGGAUCUACGGGUUUU-3'）和模拟物对照（RNA oligo 干粉）（正义链：5'- UUGUACUACACAAAAGUACUG -3'；反义链：5'- GUACUUUUGUGUAGUACAAUU -3'）和RNA 转染试剂，上海生工生物工程公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 单抗（二抗），北京中杉金桥公司；ECL 发光液，北京庄盟公司。Varioskan Flash 光谱扫描多功能酶标仪和紫外分光光度计，美国Thermo公司；PowerPac164-5050 电泳仪，美国Bio-Rad 公司；Tanon5200 全自动化学发光成像仪，上海天能公司；BD FACS Calibur 流式细胞仪，美国BD 公司；7500 Fast实时荧光定量PCR系统，美国ABI公司；超速离心机（XPN-80），美国Beckman公司；纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）仪，德国Particle Metrix公司。

1.2 细胞传代和培养

配制含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，并添加IL-3（终浓度0.5 μg·L-1）作为FDC-P1 细胞培养液，细胞悬浮生长，每2 d 传代1 次。以含有10%胎牛血清α-MEM 为DPSC 细胞培养基，待细胞生长至80%～90%融合度时传代。细胞置37℃，5% CO2恒温细胞培养箱中培养。

1.3 DPSC-EV提取

复苏第3 代（P3 代）的DPSC，扩增培养，细胞密度至60%～70%时，更换无血清培养基，继续培养2 d 后收集细胞上清。将上清于300×g，4℃离心10 min，弃沉淀；上清再经2000×g，4℃离心20 min，弃沉淀后将上清10 000×g，4℃再次离心30 min。之后将上清进行超速离心，4℃，100 000×g，70 min。离心结束后，弃管中液体，用2～3 mL 冷的PBS 反复吹洗冲刷管壁管底，吸取液体移至新的超速离心管中，进行第2次超速离心，4℃，100 000×g，70 min。离心结束后弃上清，用200 μL 冷的PBS反复吹洗冲刷管壁管底，充分重悬后将提取的EV分装至小EP管中，即DPSC-EV，于-80℃保存。

1.4 DPSC-EV鉴定

1.4.1 Western印迹法检测DPSC-EV表面CD9和CD73表达

用Western 印迹法检测DPSC-EV 中EV 标志CD9 和亲本细胞标志CD73 表达，β 微管蛋白作为内参蛋白。BCA 法测定蛋白质浓度后，在样本中加入5×上样缓冲液（4∶1）后混匀，于100℃金属浴加热10 min。将蛋白质样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，待蛋白条带分离后转至PVDF 膜，加入快速封闭液封闭30 min。之后剪切条带加入相应一抗（抗CD9 抗体，1∶1000 稀释；抗CD73 抗体，1∶1000 稀释；抗β 微管蛋白抗体，1∶1000 稀释），4℃摇床上孵育过夜。TBST 洗膜4 次，每次5 min。加入二抗（1∶5000 稀释），室温孵育1 h；TBST 洗膜4 次，每次5 min。在膜表面滴加发光液，曝光显影，据蛋白条带显色对待测蛋白进行定性分析。

1.4.2 NTA法分析DPSC-EV粒径

取冻存于-80℃的DPSC-EV，室温融化后，置4℃保存，用PBS 进行适当倍数稀释，使用NTA 仪初测颗粒密度；随后调节颗粒密度至（5～10）×1010L-1，再次检测DPSC-EV颗粒数目和粒径大小分布。

1.5 miR-100-5p抑制剂和模拟物转染FDC-P1细胞

将生长状态良好的FDC-P1细胞按合适的密度接种，使其24 h 内生长密度达到60%～80%。分别将mmu-miR-100-5p 抑制剂和抑制剂对照及mmumiR-100-5p 模拟物和模拟物对照RNA oligo 干粉用DEPC 水溶解后，配制为RNA oligo 20 μmol·L-1的母液。在无血清的RPMI 1640 培养基中分别加入RNA 转染试剂和上述RNA oligo 母液，使RNA oligo 终浓度为10 nmol·L-1。两管混匀后，室温放置5～10 min，以形成miRNA/RNA转染试剂复合物，之后将复合物加入细胞中，在CO2培养箱中37℃温育培养24 h。

1.6 FDC-P1细胞分组和处理

1.6.1 观察辐射对细胞的损伤作用

设正常对照、2 和6 Gy 照射组，将生长状态良好的FDC-P1 细胞接种于6 孔板内，使用60Co γ 射线2 和6 Gy 对细胞进行照射，之后立即更换新鲜的完全培养基。照射后24 和48 h 检测细胞凋亡率和凋亡标志物蛋白表达水平。

1.6.2 观察DPSC-EV对辐射损伤细胞的保护作用

设正常对照、2和6 Gy照射组及2和6 Gy+DPSCEV 干预组，DPSC-EV 干预组照射后立即加入DPSC-EV 5×1011L-1孵育24 h，随后检测细胞凋亡率、凋亡标志物蛋白表达水平和miR-100-5p 表达水平。

1.6.3 观察miR-100-5p 在DPSC-EV 保护辐射损伤细胞中的作用

设miR-100-5p 抑制剂组和抑制剂对照组。在FDC-P1 细胞照射前24 h，转染miR-100-5p抑制剂以敲低miR-100-5p，转染抑制剂对照作为阴性对照。2组细胞经2 Gy照射后，加入DPSC-EV 5×1011L-1孵育24 h，检测细胞miR-100-5p 表达水平和细胞凋亡率。

1.6.4 观察miR-100-5p对细胞辐射损伤的干预作用

设miR-100-5p 模拟物组和模拟物对照组。在FDC-P1 细胞照射前24 h，转染miR-100-5p 模拟物以过表达miR-100-5p，转染模拟物对照作为阴性对照。2 组细胞经2 Gy 照射后更换新鲜完全培养基，培养24 h 后检测细胞miR-100-5p 表达水平和细胞凋亡率。

1.7 流式细胞术检测FDC-P1细胞凋亡率

收集1.6.1～1.6.4 处理的细胞悬液于流式管中，400×g离心5 min；PBS 洗2 次，300×g离心5 min；每管加入结合缓冲液500 μL，FITC-Annexin-Ⅴ5 μL 和PI 5 μL，室温避光孵育15 min；使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 Western印迹法检测FDC-P1细胞胱天蛋白酶3和PARP及其活化蛋白表达

收集1.6.1 和1.6.2 处理的细胞，加入RIPA 裂解细胞，在冰上置30 min 后12 000×g，4℃离心15 min，吸取上清。用Western 印迹法检测FDCP1 细胞胱天蛋白酶3 和PARP 及其活化蛋白表达。以β 肌动蛋白作为内参对照。显影曝光后使用Image J 软件定量分析蛋白条带积分吸光度（integrated absorbance，IA）值，用IA待测活化蛋白/IA待测蛋白比值表示待测蛋白相对活化水平。

1.9 RT-qPCR检测FDC-P1细胞miR-100-5p表达

收集1.6.2～1.6.4 处理的细胞悬液，离心后加入500 μL 裂解缓冲液，用力吹吸数次使细胞充分裂解；再加入500 μL无水乙醇充分混匀，将液体加入离心柱，12 000×g离心1 min；加入500 μL洗液洗涤。之后向RNA 柱膜中心部位加入25 μL 洗脱液以洗脱RNA，用紫外分光光度计测定RNA 浓度。配制20 μL cDNA 合成反应体系：miRNA 逆转录反应混合液10 μL，miRNA 逆转录反应酶混合物2 μL，总RNA 2 μg，无RNA 酶水补至20 μL，反应混合物于37℃温浴60 min，然后85℃加热5 min 使酶失活，4℃保存。将获得的cDNA 反应液稀释50 倍后作为模板。配制20 μL miRNA RT-PCR 反应体系：miRNA RT-PCR 反应混合液10 μL，上游引物和下游引物0.5 μL，模板cDNA 1.5 μL，ROX 染料1 μL，无RNA 酶水补至20 μL，在ABI Prism7500 Fast 仪器上设置反应程序：预变性95℃30 s，变性95℃5 s；退火、延伸各60℃30 s，40个循环，据仪器设置熔解曲线程序。miR-100-5p表达水平用2-△△Ct表示。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 γ射线照射导致FDC-P1细胞凋亡

流式细胞术测定结果（图1）显示，与细胞对照组相比，2 和6 Gy 照射组在照射后24 和48 h，细胞凋亡率均显著增加（P＜0.01），且6 Gy照射组均显著高于2 Gy 照射组（P＜0.01），表明FDC-P1 细胞对γ射线敏感，γ射线照射可导致FDC-P1细胞凋亡。

2.2 γ射线照射上调FDC-P1 细胞胱天蛋白酶3 和PARP蛋白活化水平

Western 印迹实验结果（图2）显示，照射后24 h，2 和6 Gy 照射组FDC-P1 细胞胱天蛋白酶3和PARP 蛋白活化水平与细胞对照组相比均显著升高（P＜0.01），且6 Gy 照射组明显高于2 Gy 照射组（P＜0.05，P＜0.01）；照射后48 h，与细胞对照组相比，2 Gy 照射组PARP 蛋白活化水平显著升高（P＜0.01），6 Gy 照射组胱天蛋白酶3 和PARP 蛋白活化水平均显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且PARP蛋白活化水平高于2 Gy照射组（P＜0.05）。

2.3 DPSC-EV抑制γ射线导致的FDC-P1细胞凋亡

Western印迹法和NTA结果（图3）显示，提取的DPSC-EV表达EV特异分子CD9和DPSC表面标志CD73，其粒径大小均值为156.7 nm。流式细胞术结果（图4）显示，与细胞对照组相比，经γ 射线照射后24 h，2和6 Gy照射组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；加入DPSC-EV干预后，与相同剂量照射组相比，细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。由此表明，DPSC-EV对γ射线所致FDC-P1细胞凋亡具有抑制作用。

2.4 DPSC-EV 抑制γ 射线照射FDC-P1 细胞胱天蛋白酶3和PARP蛋白活化水平

图5A 显示，与正常对照组相比，2 和6 Gy 照射组FDC-P1 细胞胱天蛋白酶3 活化水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；加入DPSC-EV 后，与相同剂量照射组比较，胱天蛋白酶3 活化水平未明显变化。图5B 显示，与细胞对照组相比，2 和6 Gy 照射组PARP 蛋白活化水平显著升高（P＜0.01）；加入DPSC-EV 可显著降低PARP 蛋白活化水平（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 DPSC-EV 增强γ 射线照射FDC-P1 细胞miR-100-5p表达水平

图6 显示，与细胞对照组相比，经γ 射线2 Gy照射后24 h，FDC-P1细胞miR-100-5p表达水平显著降低（P＜0.01）；加入DPSC-EV 干预后，细胞miR-100-5p表达水平，明显高于2 Gy照射组（P＜0.01）。

2.6 miR-100-5p抑制剂减弱DPSC-EV对FDC-P1细胞凋亡的抑制作用

图7显示，FDC-P1细胞经2 Gy γ射线照射后24 h，与抑制剂对照组相比，mmu-miR-100-5p抑制剂处理组FDC-P1 细胞miR-100-5p 表达水平显著降低（P＜0.01），且细胞凋亡率显著升高（P＜0.01），提示敲低miR-100-5p 表达可减弱DPSC-EV 对FDC-P1细胞凋亡的抑制作用。

2.7 miR-100-5p模拟物抑制γ射线照射所致FDC-P1细胞凋亡

RT-qPCR 结果（图8A）显示，经2 Gy γ 射线照射后24 h，mmu-miR-100-5p模拟物处理组FDC-P1细胞miR-100-5p 表达水平明显高于模拟物对照组（P＜0.01）。流式细胞仪测定结果（图8B）表明，与模拟物对照组相比，mmu-miR-100-5p 模拟物处理组FDC-P1 细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。提示上调miR-100-5p表达可降低γ射线诱导的FDC-P1细胞凋亡。

3 讨论

越来越多的研究认为，MSC 对辐射损伤的干预作用可能并不主要依赖于细胞在损伤部位的定植和分化，如静脉注射MSC 后，损伤区域内检测到的MSC 数量很少，但组织造血功能显著恢复［8-9］。据报道，MSC对辐射等损伤的修复作用主要依赖于其旁分泌功能，即通过分泌EV 并释放多种细胞因子作用于局部微环境［4］。

人体几乎所有类型的细胞均能分泌EV。根据其来源、释放途径和颗粒大小，EV 可分为不同的亚型。MSC分泌的EV主要包括外泌体和微囊泡。多囊体与细胞膜融合，释放其内容小泡至细胞外所形成的直径30～150 nm 的囊泡为外泌体［10］；细胞直接出芽、脱落形成的直径150～1000 nm的囊泡称为微囊泡［11］。它们可通过内吞作用或直接与细胞膜融合，或通过受体配体相互作用进入细胞质，将生物信息传递给靶细胞，发挥生物功能，调节异常微环境［12］。MSC 分泌的EV 已被提出作为干细胞治疗的替代方案，用于一些受损器官再生［13］。DPSC是一种理想的干细胞来源，其提取过程简便且易于量产，不涉及伦理问题，还可用于基因工程［14］。DPSC-EV 具有低免疫原性特点和促组织再生等功能，已在多种疾病和损伤修复中广泛应用［15］。

本研究收集DPSC 细胞培养上清，使用超速离心法分离提取DPSC-EV。Western 印迹法及粒径分析的鉴定结果显示，提取的DPSC-EV 表达EV 特异性CD9 和DPSC 特异性表面标志CD73，其颗粒直径均值为156.7 nm。本研究结果表明，DPSCEV 可有效抑制γ 射线照射所导致的小鼠骨髓细胞FDC-P1发生凋亡，且抑制PARP 的激活，具有良好的抗凋亡作用。但本研究未区分外泌体和微囊泡的作用。

EV 可在细胞间传递蛋白质、脂质和核酸等，从而影响受体和亲本细胞的各种生理和病理功能［16］，它可通过调节miRNA 对受体细胞发挥调控作用［17］。miRNA是重要的表观遗传调控因子，其对细胞生长、增殖、凋亡、分化、迁移和代谢均有影响［18］。本实验室前期研究表明，DPSC-EV 在体外对细胞凋亡有抑制作用；还发现EV 中的miRNA 可能在减轻辐射损伤中发挥重要作用［15］。miR-100-5p 是miRNA 家族的重要成员，与多种疾病和病理过程相关联［19-20］。例如，转染miR-100-5p 模拟物可增强细胞活力，抑制肾癌细胞凋亡，促进其迁移和侵袭［21］；MSC-EV 中的miR-100-5p 可抑制环状菌株诱导的关节软骨细胞活性氧产生和细胞凋亡［22］。本研究结果表明，辐射后的FDC-P1 细胞miR-100-5p 表达水平显著降低，给予DPSC-EV 处理后其表达水平又明显恢复，同时伴随着细胞凋亡率降低；用miR-100-5p 抑制剂处理FDC-P1 细胞会减弱DPSC-EV 对细胞凋亡的抑制作用。另外还发现，转染miR-100-5p 模拟物对γ 射线导致的FDC-P1细胞凋亡也同样具有改善作用。上述结果提示，DPSC-EV 可通过调节靶细胞miRNA 的表达发挥其对细胞凋亡的调控作用。

综上，本研究结果表明，DPSC-EV 可通过调控照射后FDC-P1细胞miR-100-5p表达水平、抑制细胞凋亡而发挥对辐射细胞的保护作用。该研究结果将为抗辐射损伤提供潜在靶点。

本研究还存在许多不足和局限性。例如，本研究以小鼠骨髓细胞系作为研究对象进行实验，实验结果尚需在人造血细胞系、原代细胞以及体内实验验证；FDC-P1 细胞miR-100-5p 水平的改变如何影响细胞凋亡及其下游靶蛋白和信号分子仍待阐明。另外，在照射后的FDC-P1 细胞中，除miR-100-5p外，本研究还检测到了其他表达水平显著改变的miRNA，如miR-23a-5p，miR-92a-2-5p 等（待发表），这些相关的miRNA 可能在细胞的辐射损伤中发挥了其他重要作用，如影响细胞增殖、调节炎症反应等，提示DPSC-EV 对靶细胞的调控信号复杂多样，在后续实验中应进一步阐明DPSC-EV 在辐射损伤及修复过程中发挥作用的分子机制。