不同提取方法对红松籽油甾醇浸提及功能性质影响的研究

王莉莉， 赵庆佳， 张 娜， 郭庆启,3

(东北林业大学林学院1，哈尔滨 150040) (哈尔滨商业大学食品工程学院2，哈尔滨 150076) (黑龙江省森林食品资源利用重点实验室3，哈尔滨 150040)

植物甾醇属于三萜烯化合物[1]，通过竞争作用降低胆固醇在小肠内的溶解度和吸收[2]，从而降低人体胆固醇水平。研究表明，植物种子油中植物甾醇含量为0.956～3.527 mg/g，通常以结合态和游离态的形式广泛存在于各种坚果、种子和植物油中[3]。国内外研究发现，植物甾醇具有降血脂[4]、预防心血管疾病[5]、抗肿瘤[6]、减肥[7]等作用，在食品、医药及化妆品等领域得到广泛应用[8]。

近年来，人们广泛关注安全高效的天然提取物及其活性，同时适宜的提取方法也是研究的热点。传统热辅助回流提取耗能耗时，因此基于外部能量场的辅助提取被认为省时高效以及耗能较低[9，10]。目前关于提取方法对植物甾醇提取效果的影响已有报道，如庞利苹等[11]、夏秋敏等[12]、郭瑞等[13]等分别采用微波辅助提取、超声波辅助提取、超声波辅助皂化提取了南瓜籽甾醇、苹果籽甾醇、麦角甾醇，得率分别为0.892、2.183、0.880 mg/g，均高于普通的溶剂提取法。而高虹等[14]对比超声波法、微波法与溶剂法提取麦角甾醇，发现微波法的提取率比溶剂法和超声波法提高约30%，但是3种方法对其功能性质的影响并未深入研究。目前国内外对于植物甾醇的研究多集中在不同原料来源的提取及纯化等方面，同时对于其抗炎、抗氧化以及生理活性等功能的研究也较为全面，但关于同种原料、不同方法对植物甾醇的提取效果和功能性质影响的比较与分析则是鲜有报道。

本研究以有机溶剂浸提法(简称“溶剂法”)为基础，以红松籽油甾醇得率为指标，考察超声波辅助溶剂法(简称“超声波法”)、微波辅助溶剂法(简称“微波法”)、光波辅助溶剂法(简称“光波法”)对红松籽油甾醇提取效果及功能性质的影响。旨在选出一种提取得率高，对功能性质影响小的甾醇提取方法，为红松籽油甾醇的制备及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红松(Pineskoraiensis)籽食品级，胆固醇标准品(≥98%)，4-硝基苯酚丁酸酯，猪胰脂肪酶(30 000 u/g)，奥利司他(98%)，牛磺胆酸钠(97%)，甘氨胆酸钠盐水合物(98%)，2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐(ABTS+)自由基(≥98.0%)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基(≥97%)，胰蛋白酶(>250 N.F.U/mg)，胃蛋白酶(≥250 u/mg)，其他所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU1900 紫外-可见分光光度计，SCIE-NTZ-IIDM 微波光波超声波萃取仪，Scientz-18N 冷冻干燥机。

1.3 实验方法

1.3.1 红松籽油的制备

将红松籽手工去壳去皮，60 ℃鼓风干燥箱中烘干至恒质量，取100.00 g红松籽用粉碎机粉碎，按料液比1∶5 加入正己烷，浸提12 h后过滤，取滤液在45 ℃条件下真空旋转蒸发，制得红松籽油。

1.3.2 红松籽油甾醇的制备

称取一定质量的红松籽油于锥形瓶中，按料液比加入一定浓度KOH-乙醇溶液，利用不同方法(溶剂法、超声波法、微波法、光波法)处理后，溶剂萃取分离，合并有机相后用0.5 mol/L KOH溶液洗3次，蒸馏水洗至中性，再加入无水硫酸钠除去水分，取滤液在45 ℃条件下真空浓缩至恒质量[15]，制得红松籽油甾醇。

以溶剂法确定的料液比、KOH-乙醇溶液浓度、时间、温度和萃取溶剂为基础，分别对超声波法、微波法、光波法提取红松籽油甾醇的功率和时间进行研究，以红松籽油甾醇得率为指标，详细考察不同方法单独处理较短时间以及处理后再次浸提，红松籽油甾醇得率的变化情况，进一步考察不同提取方法对红松籽油甾醇抗氧化、胰脂肪酶活性与胆酸盐结合能力的影响。

1.3.3 红松籽油甾醇得率的测定方法

采用磷硫铁显色法测定甾醇得率[16]，用无水乙醇溶液将胆固醇配制成质量浓度为0、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 mg/mL的胆固醇标准溶液，取4 mL不同质量浓度的胆固醇标准溶液，分别加入2 mL磷硫铁显色剂，反应15 min后在480 nm条件下测定溶液的吸光度值，以胆固醇质量浓度C为横坐标，以吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为y=4.910 5x-0.000 7，(R2=0.999)；按式(1)计算红松籽油甾醇得率。

(1)

式中：Y为红松籽油甾醇得率/mg/g；C为红松籽油甾醇溶液的质量浓度/mg/mL；V为定容体积/mL；b为稀释倍数；m为红松籽油的质量/g。

1.3.4 红松籽油甾醇功能性质的测定

利用无水乙醇溶液将最佳条件下不同方法提取的红松籽油甾醇溶解，调至统一浓度作为母液，配置不同浓度的红松籽油甾醇溶液测定其功能性质。IC50表示自由基清除率或脂肪酶抑制率达到50%时，样品的浓度。IC50通过SPSS 软件(IBM SPSS Statistics 24.0)回归分析计算。

1.3.4.1 DPPH·清除能力的测定

准确移取2 mL不同浓度的红松籽油甾醇溶液，分别加入2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)，反应30 min后，517 nm条件下测定溶液的吸光度值[17]。按式(2)计算DPPH·清除率。

(2)

式中：Ai为红松籽油甾醇溶液与自由基混合溶液的吸光度值；Aj为红松籽油甾醇溶液与无水乙醇混合溶液的吸光度值；A0为自由基溶液和无水乙醇混合溶液的吸光度值。

1.3.4.2 ABTS+·清除能力的测定

取1 mL不同浓度的红松籽油甾醇溶液，分别加入5 mL稀释后的ABTS+和过硫酸钾混合液，摇匀避光反应30 min，734 nm条件下测定溶液的吸光度值[18]。按式(2)计算ABTS+·清除率。

1.3.4.3 胰脂肪酶抑制能力的测定

以4-硝基苯酚丁酸酯为底物，采用对硝基苯酚法测定红松籽油甾醇对胰脂肪酶活性的抑制能力[19]。取不同浓度的红松籽油甾醇溶液50 μL与胰脂肪酶液(5 mg/mL)100 μL混合，37 ℃保温10 min，加入4-硝基苯酚丁酸酯(5 mmol/L)100 μL，37 ℃保温10 min后，405 nm条件下测定溶液的吸光度值。以Tris-HcL缓冲液(100 mmol/L)为空白对照，奥利司他为阳性对照。按式(3)计算胰脂肪酶抑制率。

(3)

式中：A2样品组(红松籽油甾醇溶液)的吸光度值；A1为反应体系中无胰脂肪酶组吸光度值；A0为空白对照组吸光度值。

1.3.4.4 胆酸盐结合能力的测定

采用模拟体外消化实验法测定胆酸盐结合能力[20]。以0.4 mmol/L 甘氨胆酸钠、0.5 mmol/L 牛磺胆酸钠为母液，用0.1 mol/L pH 6.3 磷酸缓冲溶液配置不同浓度的甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠溶液，分别移取1 mL不同浓度的胆酸盐溶液加入3 mL 60% 硫酸溶液，70 ℃水浴20 min，冰浴5 min，387 nm条件下测定溶液的吸光度值。以浓度C为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线。得到牛磺胆酸盐标准曲线方程为：y=1.901 7x+0.047 5(R2=0.998)；甘氨胆酸盐标准曲线方程为：y=1.63x+0.057(R2=0.999)。

取3 mL不同浓度红松籽油甾醇溶液，加3 mL胃蛋白酶(10 mg/mL)和1 mL HCl溶液(0.01 mol/L)，37 ℃振荡消化1 h，用NaOH溶液(0.1 mol/L)调节pH6.3，加入4 mL胰蛋白酶(10 mg/mL)，37 ℃振荡消化1 h，加入4 mL胆酸盐溶液(0.4 mmol/L甘氨胆酸钠、0.5 mmol/L牛磺胆酸钠)，37 ℃振荡消化1 h，8 000 r/min离心10 min，取上清液进行分析。按式(4)计算胆酸盐结合率。

(4)

式中：C1为胆酸盐加入量/μmol；C2为胆酸盐剩余量/μmol。

1.4 数据统计与分析

数据结果采用平均值±标准差表示，使用SPSS 24.0、Excel 2010与Origin 2018软件进行图表绘制及数据分析。

2 结果与分析

2.1 红松籽油甾醇提取工艺的研究

2.1.1 料液比对红松籽油甾醇得率的影响

如表3、表4所示，油脂与碱性物质结合后，以酯态形式存在的甾醇被水解为对应的植物甾醇，生成溶于水的高级脂肪酸盐、甘油和不溶于水的甾醇，甾醇可通过有机溶剂萃取制备。在KOH-乙醇溶液浓度为1 mol/L、时间120 min、温度75 ℃、萃取溶剂为乙酸乙酯的条件下，考察料液比对红松籽油甾醇得率的影响，结果如图1。

注：图中小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。图1 料液比对红松籽油甾醇得率的影响

料液比为1∶4 时红松籽油甾醇得率最大(P<0.05)，此时红松籽油和KOH-乙醇溶液反应完全，当料液比小于1∶4 时，红松籽油和KOH-乙醇溶液未完全反应，致使与脂肪酸结合的甾醇未完全游离出来，溶剂萃取游离甾醇时，导致少部分结合态甾醇受到损失。料液比大于1∶4 时红松籽油甾醇基本已经浸出，而过大的料液比会使其他物质溶出，反而影响红松籽油甾醇得率。红松籽油甾醇得率随料液比先增大后减小的趋势与赵茜茜等[21]提取文冠果仁油甾醇相似，因此选择料液比为1∶4。

2.1.2 KOH-乙醇溶液浓度对红松籽油甾醇得率的影响

在料液比为1∶4、时间120 min、温度75 ℃、萃取溶剂为乙酸乙酯的条件下，考察KOH-乙醇溶液浓度对红松籽油甾醇得率的影响，见图2。氢氧化钾在提取过程中起催化作用，可以解离出酯态甾醇[14]，但红松籽油在氢氧化钾溶液中的溶解度有限，故加入乙醇来增加红松籽油在氢氧化钾溶液中的溶解度，加快反应的进行。随KOH-乙醇溶液浓度的增加，红松籽油甾醇得率呈先上升后下降趋势，当KOH-乙醇溶液浓度为1 mol/L时，红松籽油甾醇得率最大(P<0.05)，达到(1.763±0.046) mg/g，当浓度继续增大时，氢氧化钾残留过多，水洗次数过多导致甾醇得率下降，因此选择溶液浓度为1 mol/L。

图2 KOH-乙醇溶液浓度对红松籽油甾醇得率的影响

2.1.3 浸提时间对红松籽油甾醇得率的影响

在料液比1∶4、KOH-乙醇溶液浓度1 mol/L、温度75 ℃、萃取溶剂为乙酸乙酯的条件下，考察浸提时间对红松籽油甾醇得率的影响，结果如图3。

图3 浸提时间对红松籽油甾醇得率的影响

浸提时间60～90 min红松籽油甾醇得率快速增长，90 min时得率最大(P<0.05)，达到(1.915±0.055) mg/g，90～180 min红松籽油甾醇得率呈显著下降趋势。陈佳丽等[22]认为当提取时间达到平衡点后，溶剂总量等因素会破坏甾醇的溶解能力，导致甾醇得率下降，故选择浸提时间为90 min。

2.1.4 浸提温度对红松籽油甾醇得率的影响

料液比为1∶4、KOH-乙醇溶液浓度为1 mol/L、时间90 min、萃取溶剂为乙酸乙酯的条件下，考察浸提温度对红松籽油甾醇得率的影响，结果如图4。

图4 浸提温度对红松籽油甾醇得率的影响

温度从70 ℃至80 ℃，红松籽油甾醇得率快速上升，当超过80 ℃时得率略有下降。这可能是在较高的温度下处理较长时间，导致红松籽油甾醇降解加快，时间过长红松籽油甾醇发生包裹且有其他杂质溶出导致得率下降。当干燥温度超过80 ℃时，会加快油菜中的部分甾醇的降解速率[23]，故选择80 ℃为浸提温度。

2.1.5 浸提后萃取溶剂对红松籽油甾醇得率的影响

在料液比为1∶4、KOH-乙醇溶液浓度为1 mol/L、时间90 min、温度80 ℃的条件下，考察萃取溶剂对红松籽油甾醇得率的影响，结果如图5。

图5 萃取溶剂对红松籽油甾醇得率的影响

红松籽油甾醇得率与溶剂和提取液的分层程度以及是否形成乳化液有关，用石油醚萃取时，分层不清晰导致红松籽油甾醇损失。由图5可知5种溶剂萃取红松籽油甾醇得率顺序为乙酸乙酯>正己烷>乙醚>氯仿>石油醚，庞丽萍等[11]利用微波法筛选溶剂对南瓜籽甾醇提取率的影响时发现乙酸乙酯提取效果最好，乙酸乙酯相对安全且符合GB 2760—2014中允许使用的食品加工助剂。因此确定乙酸乙酯为萃取溶剂。

溶剂法提取最佳工艺条件为：料液比1∶4 ，KOH-乙醇溶液浓度1 mol/L，浸提时间90 min，温度80 ℃，萃取溶剂为乙酸乙酯，此工艺条件下红松籽油甾醇得率为(2.129±0.046) mg/g。

2.2 不同提取方法对红松籽油甾醇得率的影响

2.2.1 超声波法对红松籽油甾醇得率的影响

如表3、表4所示，以溶剂法确定的最佳条件为基础，通过单因素实验确定超声波法、微波法、光波法的浸提功率和时间，单一方法处理后继续浸提至总时间为90 min，考察红松籽油甾醇得率的变化情况。不同超声波时间和功率处理条件下的甾醇得率结果如表1、表2所示。

表1 超声波时间对红松籽油甾醇得率的影响

表2 超声波功率对红松籽油甾醇得率的影响

超声波法(560 W，40 min)提取的红松籽油甾醇得率最高(P<0.05)，为(2.134±0.010) mg/g，超声波后继续浸提甾醇得率为(2.347±0.013) mg/g。超声波法提取是通过破碎、侵蚀、毛细化、脱纹理等不同的独立或联合机制起作用[24]。随功率和时间的增长，加速分子碰撞，细胞破裂，红松籽油甾醇溶出量越多得率增大，当膜破碎完全后杂质溶出越多得率下降。王丽波等[25]从南瓜籽油中以乙酸乙酯为提取溶剂，超声功率500 W，时间50 min时甾醇的含量为1.106 mg/g。对比超声波法单独处理及处理后继续浸提，红松籽油甾醇得率的变化情况，发现超声波(560 W，40 min)时单独提取比例占总量的(90.925±0.156)%，继续浸提50 min后得率占总量的(9.075±0.312)%，表明超声波法短时间内便可提取出大部分红松籽油甾醇。

2.2.2 微波法对红松籽油甾醇得率的影响

如表3、表4所示，微波功率500 W，时间1 min时红松籽油甾醇得率最高(P<0.05)，为(2.263±0.013) mg/g，微波后继续浸提甾醇得率为(2.289±0.015) mg/g，随微波功率和时间的增长，红松籽油甾醇的得率下降。这可能是当微波功率小于500 W时，随微波功率增大，微波效应增强，红松籽油细胞内极性分子加速振动使甾醇快速溶出，得率增加，而微波功率大于500 W时，杂质开始溶出，导致红松籽油甾醇得率下降。徐艳阳等[26]以微波功率539 W，微波时间41 s提取桑白皮中甾醇，发现功率超过539 W甾醇得率下降。微波提取是300 MHz～300 GHz的频带内进行的[27]。微波加热有偶极重定向和离子极化两种机制，在微波应用中，当偶极子与电场重新排列时，分子发生碰撞产生热量，离子向电场移动时，离子发生碰撞产生热量[28]。微波萃取时间短、溶剂消耗少、效率高，但容易导致极热敏化合物的降解[10]。

表3 微波功率对红松籽油甾醇得率的影响

表4 微波时间对红松籽油甾醇得率的影响

2.2.3 光波法对红松籽油甾醇得率的影响

如表5、表6所示，光波功率440 W，时间10 min时红松籽油甾醇得率最高(P<0.05)，为(2.198±0.010) mg/g，这可能是光波的迅速制热功能使红松籽油与KOH-乙醇溶液快速充分反应，与脂肪酸结合的键快速断裂甾醇单体游离出来，之后随光波功率和时间的增长，红松籽油中脂肪酸与乙醇反应生成脂肪酸乙酯，随溶剂与甾醇一起萃取出来，导致甾醇得率下降。

表5 光波功率对红松籽油甾醇得率的影响

表6 光波时间对红松籽油甾醇得率的影响

当超声波法、微波法、光波法单独处理时，微波法(500 W、1 min)提取的红松籽油甾醇得率最高(2.263±0.013)mg/g，单独提取比例占总量的(98.864±0.160)%，继续浸提89 min后得率占总量的(1.136±0.320)%。超声波法、光波法单独提取比例分别为(90.925±0.156)%、(97.950±0.244)%，表明超声波法、微波法、光波法单独提取红松籽油甾醇在总提取过程中起主导作用。高虹等[14]、徐艳阳等[26]对比超声波法、微波法与溶剂法提取麦角甾醇、桑白皮甾醇，发现微波法提取效果最好。而Oludemi等[29]利用热辅助、超声、微波提取从姬松茸残渣中提取麦角甾醇，认为超声提取法效果最好，能够获得高含量麦角甾醇。胡代花等[30]比较了乙醇超声提取、超声辅助皂化提取和传统回流提取金针菇的麦角甾醇时发现乙醇超声提取更完全，效率更高。有研究认为认为超声波法提取植物甾醇更具有实用价值，可显著降低能耗[13,31,32]。

2.3 不同方法提取红松籽油甾醇对自由基的清除效果

对溶剂法最佳条件、超声波法(560 W，40 min)、微波法(500 W，1 min)、光波法(440 W，10 min)单独处理时提取的红松籽油甾醇清除自由基能力进行测定，结果见图6。不同方法提取的红松籽油甾醇都具有抗氧化性，且红松籽油甾醇和VE的浓度与DPPH·、ABTS+·清除率成正相关。由图6a看出不同方法提取的红松籽油甾醇质量浓度为2 mg/mL时，DPPH·清除率均达到最大且超声波法、微波法和溶剂法提取的甾醇对DPPH·清除效果差异不显著(P>0.05)，其IC50值分别为(0.802±0.063)、(0.785±0.041)、(0.882±0.043) mg/mL，而光波法DPPH·清除率为(89.692±2.102)%，IC50为(0.987±0.032) mg/mL。这可能是光波能迅速制热使细胞内溶物沸腾破坏了红松籽油甾醇的活性。而超声波能促进有效物质溶出，不易破坏物质的化学结构[33]。由图6b可以看出红松籽油甾醇质量浓度在1～4 mg/mL ABTS+·清除率呈快速上升趋势并趋于稳定。红松籽油甾醇质量浓度为1 mg/mL时，不同处理方法对ABTS+·清除效果表现为超声波法>微波法>光波法>溶剂法。红松籽油甾醇质量浓度为4 mg/mL，不同处理方法对ABTS+·清除效果差异不显著(P>0.05)，均表现为较好的抗氧化效果。田丹丹等[34]发现牛油果中植物甾醇因有较多β-谷甾醇使DPPH·清除率高于VE，且由于植物甾醇C-3位极性羟基中的氢电子转移给了自由基，清除了DPPH·达到抗氧化效果。朱雪梅等[35]发现松籽油中仅含有β-谷甾醇和菜籽甾醇，且β-谷甾醇是菜籽甾醇的8倍。表明红松籽油甾醇具有良好的抗氧化能力。

2.4 不同方法提取红松籽油甾醇对胰脂肪酶活性的抑制效果

如图7所示，不同方法提取的红松籽油甾醇均随着浓度的增大，胰脂肪酶抑制率增大。红松籽油甾醇质量浓度在0.6～1.8 mg/mL内，光波法提取的红松籽油甾醇相较于其他3种方法对胰脂肪酶抑制活性差异显著(P<0.05)。红松籽油甾醇质量浓度为2 mg/mL时，4种方法提取的红松籽油甾醇对胰脂肪酶抑制率达到最大。超声波法、微波法、光波法和溶剂法提取的红松籽油甾醇对胰脂肪酶活性抑制的IC50分别为(1.322±0.020)、(1.620±0.030)、(2.056±0.024)、(1.585±0.031) mg/mL。奥利司他IC50为(0.400±0.045) mg/mL。杨鹏等[36]以奥利司他为阳性对照，发现荞麦黄酮和奥利司他对胰脂肪酶抑制的IC50分别为1.94、0.47 mg/mL。胰脂肪酶是食品中分解脂肪的主要酶之一，抑制胰脂肪酶活性，会减少三酰甘油分解，从而降低身体吸收的量而起到降脂作用[37]。研究表明植物甾醇可以抑制与胆固醇吸收有关的酶活性[38]。奥利司他作为胰脂肪酶抑制剂，通过共价修饰活性位点抑制胰腺脂肪酶，降低机体对脂肪的吸收[39]。

图7 不同方法提取红松籽油甾醇对胰脂肪酶活性抑制效果

2.5 不同方法提取红松籽油甾醇结合胆酸盐能力比较

从图8可知不同方法提取的红松籽油甾醇质量浓度在0.6～2.2 mg/mL内随浓度的增大，与牛磺酸胆酸钠、甘氨胆酸钠结合率均增大，红松籽油甾醇质量浓度在1.8～2.2 mg/mL内与两种胆酸盐结合速率上升平缓。超声波法提取的红松籽油甾醇结合率上升速率均高于其他3种方法，且当胆酸盐结合率趋于稳定后，超声波法提取的红松籽油甾醇结合率最大(P<0.05)，牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠结合率分别为(77.593±1.401)%、(77.601±1.103)%。胆汁酸是胆固醇在胆汁中衍生而来的能够加速脂类消化代谢引起血脂升高的大分子，胆汁酸通过酰胺键与甘氨酸或牛磺酸迅速结合，形成相应的胆酸和去氧胆酸结合物，将胆酸盐结合能够降低机体对胆固醇的吸收[38]。

3 结论

以红松籽油甾醇得率为指标，确定了溶剂法、超声波法、微波法、光波法的最佳工艺条件，其中微波法提取的红松籽油甾醇得率最大。对比超声波法、微波法、光波法处理前后红松籽油甾醇得率的变化情况，发现短时间单独处理时可提取出大部分红松籽油甾醇，在总浸提过程中起主导作用。比较4种方法对红松籽油甾醇功能性质的影响可知：微波法提取的红松籽油甾醇对DPPH·清除效果最好，与超声波法差异不显著(P>0.05)，超声波法提取的红松籽油甾醇对ABTS+·清除效果最好，并且超声波法提取的红松籽油甾醇对胰脂肪酶抑制效果及胆酸盐结合能力最强。得率虽略低于微波法，但综合考虑超声波法更适合红松籽油甾醇的开发利用。

不同提取方法对红松籽油甾醇功能性质影响的差异性，可能与活性物质的降解有关，但短时间提取出的甾醇仍然具有较高的活性，均具备较强的清除自由基、抑制胰脂肪酶活性及结合胆酸盐的能力，表现出潜在的抗氧化及降血脂效果。植物甾醇具有较高的应用价值和较大的市场发展空间，关于4种提取方法对红松籽油甾醇结构和功能关系的影响机制还需进一步研究。