离体大鼠肝脏灌流法制备氯吡格雷活性巯基代谢物Δ

刘 艺，陶 婷，刘 云，李艳丽，胡盼盼，姜艳娇，孙增先（徐州医科大学附属连云港医院/连云港市第一人民医院药学部，江苏连云港 222002）

氯吡格雷活性巯基代谢物（clopidogrel active thiol metabolite，CATM，化学结构式见图1）是氯吡格雷发挥抗血小板疗效的最终活性物质[1]。CATM 化学结构复杂，C3—C16 双键和C4 位手性结构使其具有4 种构型，分别为H1（7S，3E，4S）、H2（7S，3E，4R）、H3（7S，3Z，4S）、H4（7S，3Z，4R），其中H1 和H2 为反式CATM、H3 和H4为顺式CATM[1]。已有研究表明，人体内CATM 的构型为顺式构型[2]。目前市面上仅有反式CATM异构体H1、H2的标准品，使CATM的体内研究受限。

图1 CATM化学结构式

对CATM进行合成的现有技术中，常用的方法有化学合成法和生物酶肝微粒体催化法，其中化学合成法需要对C3—C16 双键构型和C4 位手性构型进行选择，步骤复杂[3]；生物酶肝微粒体催化法具有较高的生物选择性和转化效率，但肝微粒体成本高，酶催化反应条件严苛，同时因底物量受限难以得到足够的目标代谢产物[2]。已有研究显示，离体大鼠肝脏灌流法被广泛用于大鼠肝脏的生理、病理生理、肝损伤及药物代谢研究，兼具体外实验和整体动物实验的优点[4－6]。本实验拟采用（S）-2-氧氯吡格雷为底物，采用离体大鼠肝脏灌流法通过代谢途径制备CATM，旨在为顺式CATM的合成提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括肝脏器官灌流仪（徐州医科大学附属连云港医院临床药理实验室设计）、AKTA pure 型蛋白纯化仪（美国General Electric 公司）、DUC-23050-J00型真空冷冻干燥仪（英国GeneVac miVac公司）、Bruker avance ⅢHD 500 型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）仪（德国Bruker 公司）、Waters Acquity UPLC ⅠClass型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）、AB Qtrap 4500 型质谱仪（美国AB Sciex 公司）、T1型氮气发生器（瑞士Gravimetrics公司）等。

1.2 主要药品与试剂

（S）-2-氧氯吡格雷（批号20200105，纯度99.0%）由徐州医科大学附属连云港医院临床药理实验室自制[7]；氯化钠（批号20220417，纯度99.0%）、氯化钾（批号20160118，纯度99.5%）、七水合硫酸镁（批号20190625，纯度99.0%）、磷酸二氢钾（批号20190612，纯度99.5%）、氯化钙（批号20181012，纯度96.0%）、碳酸氢钠（批号20160219，纯度99.5%）、一水合葡萄糖（批号K1925024，纯度98.0%）均购自国药集团化学试剂有限公司；乙酸铵（批号E057G140，纯度98.0%）购自德国CNW 公司；盐酸（批号160112012H）购自南京化学试剂股份有限公司；肝素钠注射液（批号52108110，规格每2 mL 12 500 单位）购自江苏万邦生化医药集团有限责任公司；吸入用七氟烷（批号18120331，规格120 mL）购自上海恒瑞医药有限公司；硫酸氢氯吡格雷片（批号AA976，规格75 mg）购自赛诺菲（杭州）制药有限公司；氘代二甲基亚砜（批号296147，同位素纯度99.9%）购自美国Sigma 公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）均购自德国Merck公司，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯净水。

1.3 动物

SPF 级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠2 只，体质量200～250 g，由南通大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK（苏）2019-0001，使用许可证号为SYXK（苏）2018-0026。大鼠在自然昼夜照明、相对湿度40%～70%、温度12～26 ℃的环境下饲养，自由饮水、进食（普通维持饲料）。

1.4 受试者

招募1名长期服用氯吡格雷的男性稳定期冠脉综合征受试者（75 mg 维持剂量），受试者试验前被告知试验方案与目的，并签署知情同意书。试验方案经徐州医科大学附属连云港医院伦理委员会批准，批件号为LW-20220309001-01。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 Krebs-Henseleit 碳酸氢盐缓冲液 按Krebs-Henseleit 碳酸氢盐缓冲液（K-H 液）的经典配方（118 mmol/L 氯化钠，4.7 mmol/L 氯化钾，1.2 mmol/L 七水合硫酸镁，1.2 mmol/L 磷酸二氢钾，2.5 mmol/L 氯化钙，25 mmol/L碳酸氢钠[8]），再以终浓度为10 mmol/L的葡萄糖作为能量来源进行配制，具体操作如下：取氯化钠6.89 g、氯化钾0.35 g、七水合硫酸镁0.30 g、磷酸二氢钾0.16 g、碳酸氢钠2.10 g、一水合葡萄糖1.98 g、氯化钙0.27 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，再用盐酸调pH 至7.35～7.45，经0.22 μm滤膜滤过，现配现用。

2.1.2 （S）-2-氧氯吡格雷灌流液 将（S）-2-氧氯吡格雷0.008 g 充分溶解于3 mL 乙腈中，再加入至297 mL K-H液中，混匀即得。

2.2 灌流方法

根据Wang 等[9]和Ferrigno 等[10]报道的方法加以改进，具体操作如下：SD大鼠术前禁食12 h，不禁水，用七氟烷维持吸入麻醉，沿腹直线打开腹腔，将内脏轻轻横置，暴露门静脉、下腔静脉（腹腔段），迅速于门静脉注入100 单位肝素抗凝并插管固定，用提前预热至37 ℃的K-H 液以10 mL/min 的流速冲洗肝脏残血；剪开下腔静脉（腹腔段），沿腹腔中线往上剪开胸腔，分出下腔静脉（胸腔段）并插管作为灌流液的流出管，同时结扎下腔静脉（腹腔段），形成灌流通路；迅速将完整的肝脏分离出来，转移至37 ℃的灌流室中，待肝脏残血冲洗干净后，换80 μmol/L 的（S）-2-氧氯吡格雷灌流液。灌流方式为非循环灌流。

2.3 CATM 和（S）-2-氧氯吡格雷定性定量分析的色谱与质谱条件

采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography tandem mass，UPLC-MS/MS）法进行测定。色谱条件如下：以Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）为色谱柱，以10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速为0.25 mL/min；柱温为40 ℃；进样室温度为4 ℃；进样量为2 μL。质谱条件如下：采用电喷雾离子源；采用多反应监测模式扫描母离子，增强子离子模式扫描碎片离子，正离子方式检出；气帘气（N2）压力为10 psi；碰撞气模式为High；离子化电压为5 500 V；温度为200 ℃；喷雾气（N2）压力为30 psi；辅助加热气（N2）压力为30 psi；CATM、（S）-2-氧氯吡格雷的定性离子对分别为m/z356.1→356.1、m/z338.1→338.1；去簇电压分别为70、175 V；扫描时间均为100 ms；碰撞能量均为5 eV。

表1 CATM和（S）-2-氧氯吡格雷定性定量分析的梯度洗脱程序

2.4 CATM分离纯化的色谱条件

以ChromCore 120 C18制备柱（10 mm×50 mm，5 μm）为色谱柱，以水为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速为1 mL/min；进样量为100 mL。

表2 CATM分离纯化的梯度洗脱程序

2.5 CATM的制备

取80 μmol/L 的（S）-2-氧氯吡格雷灌流液300 mL，按“2.2”项下方法以约3.3 mL/min 的流速进行90 min 的非循环灌流，制备CATM。收集灌流液，经0.22 μm水系滤膜滤过，按“2.4”项下方法进行分离纯化，每间隔1 min富集纯化后的洗脱物；再按“2.3”项下方法进样，验证洗脱物组分，确定目标组分的时间收集范围；富集目标组分，冷冻干燥后，称定质量，以最终获得CATM的物质的量与灌流液中（S）-2-氧氯吡格雷的物质的量之比计算转化率。

2.6 CATM的鉴定

2.6.1 质谱鉴定 取“2.5”项下制备的目标产物，用50%甲醇溶解稀释成500 ng/mL，在正离子模式下，针泵进样，流速为7 μL/min；在母离子全扫描模式下的扫描范围为350～360 Da，扫描速度为10 Da/s，扫描时间为5 min，分别确定目标产物母离子质荷比，并得最佳去簇电压值；在子离子扫描模式下的初始碰撞能为10 eV，以5～10 eV为步长调节，扫描速度为200 Da/s，扫描时间为5 min，获得子离子信息。

2.6.2 NMR谱鉴定 以氘代二甲基亚砜[核磁共振氢谱（1H-NMR）为2.50 ppm]为溶剂分别测定目标产物的1H-NMR谱和重水交换谱。将各氢信号分类编号汇总并依据NMR命名法（化学位移、氢分布、峰分裂数）对分子的单个质子氢信号进行共振分配，通过重水交换谱验证活泼氢信号。

2.7 CATM中4种立体异构体相对纯度的测定

取500 ng/mL 目标产物，按“2.3”项下方法进样分析，按归一化法计算其相对纯度。

2.8 顺式CATM保留时间的确定

受试者口服氯吡格雷后1 h，采集前臂静脉血2 mL，置于肝素抗凝管中，即刻以4 000×g离心10 min，取上层血浆50 μL，加入乙腈250 μL，涡旋振荡5 min，再以12 000×g离心5 min，取上清液吹干后，以“2.3”项下初始比例的流动相复溶，取10 μL，按“2.3”项下方法进样分析。

3 结果

3.1 CATM的制备情况

80 μmol/L的（S）-2-氧氯吡格雷经过2次离体大鼠肝脏灌流生物转化，得灌流液580 mL，经分离纯化得目标产物2 mg，即48 μmol 的（S）-2-氧氯吡格雷生物转化得5.62 μmol 的目标产物，转化率为11.71%。分离纯化后的洗脱液中目标组分的色谱图（图2A）显示，有4个峰分别在21.5、22.6、26.7、27.9 min 时被洗脱，其相应质谱图较为相似（图2B），显示主要碎片离子为m/z155.2、182.8、212.1、296.1，与研究报道类似[11－12]，可确认这4 个峰为CATM的4个立体异构体。

图2 分离纯化后目标组分的色谱图和质谱图

3.2 目标产物的质谱鉴定结果

目标产物质谱优化后的最佳去簇电压为60 V，碰撞能量为29 eV，观察到母离子为m/z356.1、358.1，分别为35Cl和37Cl的同位素峰，峰高比约为3∶1（图3A）；主要碎片离子为m/z154.8、183.0、212.0、322.0（图3B），确认目标产物为CATM[11－12]。目标产物的裂解示意图见图4。

图3 目标产物的母离子和子离子质谱图

图4 目标产物的裂解示意图

3.3 目标产物的NMR谱鉴定结果

目标产物的1H-NMR谱和重水交换谱见图5。结果显示，7.35～7.57（4H，m）为邻位取代苯环上氢信号；5.90（1H，s）为烯氢信号；12.24（1H，brs）、3.05（1H，s）为活泼氢信号，重水交换后消失；3.63（3H，s）为甲氧基氢信号；4.71（1H，m）为连氮原子上次甲基氢信号；2.90～2.56（2H，m）、2.09～1.68（2H，m）、3.81～3.86（1H，m）、3.81～3.86（2H，m）为连氮原子上亚甲基及连硫原子上次甲基氢信号；8.32（0.2H，s）、5.20（1H，s）、1.91（0.4H，s）、7.35～7.57（1H，m）为其他杂质上氢信号，确认目标产物为CATM[2]。目标产物的1H-NMR 结果见表3（由于纯化的化合物量不足，未获得CATM的13C-NMR谱图）。

表3 目标产物CATM的1H-NMR结果（δ/ppm）

图5 目标产物的1H-NMR谱和重水交换谱

3.4 CATM中4个立体异构体的相对纯度

CATM 的峰1～峰5 的保留时间分别为10.7、21.3、22.3、26.5、27.3 min，峰面积占比（相对纯度）分别为7.14%、7.13%、7.23%、63.52%、14.97%，其中峰2～峰5为CATM的4个立体异构体。CATM的UPLC-MS/MS色谱图见图6。

图6 CATM的UPLC-MS/MS色谱图

3.5 CATM活性构型保留时间的确认及目标产物的纯度分析

受试者体内CATM的色谱图（图7）显示其只有1个主要色谱峰，保留时间为26.3 min，其为人体内的顺式CATM[2]。结合“3.4”项下结果可知，目标产物CATM 中保留时间为26.3 min左右（即26.5 min）的色谱峰峰面积占比较高（约63.52%），即目标产物CATM 中含有较高的顺式CATM。

图7 受试者体内CATM的UPLC-MS/MS色谱图

4 讨论

4.1 质谱条件

因为CATM各立体异构体的标准品尚无法商购，不能获得其母离子和子离子信息，所以在UPLC-MS/MS法中将母离子和子离子均设为母离子的质荷比，碰撞能量设为5 eV。该方法可以使母离子尽量在四极杆的子离子通道内以原型存在，随后通过离子阱对该母离子进行裂解，得到相应的质谱图，以便进行CATM 各构型的鉴定。

4.2 CATM制备纯化方法

CATM结构中的巯基基团化学性质活泼，使其制备纯化较为困难。在进行C18制备柱纯化之前，根据观察，所得到的CATM 灌流液难以保存，经0.22 μm 滤膜滤过后得到的澄清液体，在－80 ℃仅能保存7 d左右，故灌流结束后应尽快对其中的目标产物进行分离纯化，并且制备过程中的每个操作都应尽量在4 ℃和避光环境下进行，以防止其失活。在分离纯化过程中，将灌流得到的含CATM 的灌流液在AKTA pure 型蛋白纯化仪上以流动相的方式上样100 mL，分6 次通过C18制备柱分离纯化，首先以97%的水相除去灌流液体系中的无机盐，随后通过55%的水相等度洗脱CATM，最后以100%的有机相等度洗脱色谱柱中残留的（S）-2-氧氯吡格雷，洗脱收集时间范围为57～64 min。

CATM 的转化率为11.71%，转化率受以下因素影响：（1）灌流液在肝组织和灌流管路中存在损失；（2）（S）-2-氧氯吡格雷未充分转化；（3）CATM可能以其他结合形式存在；（4）CATM 在制备纯化过程中因结构不稳定造成损失。本研究中，图6 与图2A 相比，色谱峰的峰形较差，其原因与色谱柱柱效降低有关。本研究通过对比人体内CATM 活性构型的保留时间并结合文献[2]分析，确定目标产物CATM中保留时间为26.5 min的色谱峰为活性构型顺式CATM，再结合“3.4”项下结果可知，目标产物CATM中活性构型顺式CATM的占比最高。

综上所述，本研究以（S）-2-氧氯吡格雷为底物，采用离体大鼠肝脏灌流法生物转化和C18制备柱分离纯化获得目标产物，转化率为11.71%；经质谱和NMR 谱鉴定目标产物为CATM，其中顺式CATM的占比较高。该方法具有成本低、步骤较为简单的优点，但同时也存在实验操作技术要求较高的缺点。