蛋白核小球藻的培养及应用研究

岳海艳，刘小杰✉，孙 敏，李 娜，刘占峰

（1. 上海城建职业学院，上海 201415；2. 上海化工研究院有限公司，上海 200062）

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，通常以光合自养生长繁殖，分布极广。蛋白核小球藻含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质、食物纤维、核酸、不饱和脂肪酸及叶绿素等，具有降脂、降压、降血糖、预防和改善动脉粥状硬化等功能[1-2]，尤其小球藻特有的生长因子，使其具有排除体内毒素、促进新陈代谢、补充人体营养、提高细胞再生能力以及增强人体免疫力等功效[3-5]；美国和日本将小球藻作为优良食品和动物饲料添加剂已有30多年的历史，近年来，东亚和欧洲每年生产数千吨的小球藻作为饲料添加剂、保健食品和营养补充食品[6]。2012年底《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》将蛋白核小球藻列为新资源食品[7]，丰富了国内藻类健康食品种类，已经应用于大米、酿酒、豆腐、发酵乳制品、面条、饼干和面包等[8-12]，将来在功能性食品中必然有着更广阔的应用前景[13]。

目前蛋白核小球藻培养方法很多，其培养方式包括密闭无菌培养法、开放半无菌培养法、开放藻菌混养法等[14-20]。生长方式有自养和异养生长两种，随着碳氮比（C/N）和光照条件变化在自养和异养之间自由转变[21]。由于开放和半开放培养方式容易使杂菌，尤其是有害细菌进入，并繁殖，使菌体遭到污染，不宜食用；自养向异养转化过程伴有叶绿素和叶绿体的消失，类胡萝卜素和叶黄素降低，蛋白质含量减少以及脂肪急剧增加等问题[22]。因此本文探索一种利用气升反应器高密度培养食品用蛋白核小球藻的方法，即采用密闭无菌的自养方式，并首次将获得的蛋白核小球藻用于青团制作。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FAZHB-5小球藻：中科院水生生物研究所；硝酸钠（AR）、硫酸钾（AR）、柠檬酸铁铵（CP）、钨酸钠（AR）、浓硫酸（AR）、硝酸（AR）等：国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钾（AR）、氯化钙（AR）、乙二胺四乙酸二钠（AR）：上海展云化工有限公司；钼酸钠（≥99%）：上海化学试剂有限公司；硫酸镁（AR）：上海强盛功能化学股份有限公司；铁质除氧剂：上海化工研究院有限公司；糯米粉、水晶饺子粉以及豆沙馅等：市售；AccQ.Tag分析蛋白水解氨基酸方法试剂包：济南赛畅科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

IRH-IS160二氧化碳培养/振荡培养一体箱：北京陆希科技有限公司；大容量离心机：UNION 5KR Hanil Science Industrial Co., Ltd；CX41显微镜：Olympus Optical Co.，LTD；TGL-16aR台式冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；BCD626WD11HP容声冰箱：海信容声（广东）冰箱有限公司；MP1002电子天平：上海民桥电子仪器厂；HX12L-0179立式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司；GY-FYQ-1812-ZZ微藻培养光生物反应器：上海光语生物科技有限公司；海能K1100全自动凯氏定氮仪：上海力晶科学仪器有限公司；L8900全自动氨基酸分析仪：广州仪德精密仪器股份有限公司；电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）：PerkinElmer Avio200，MA，USA。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白核小球藻培养工艺

将FAZHB-5小球藻接种于无菌发酵培养基中，装置密闭，气体装置内循环，根据设置自动通入无菌二氧化碳，保持装置内二氧化碳2%浓度，氧气21%，温度25 ℃，12 h光照/d，培养8 d。

1.3.2 碳源和氮源优化

采用单因素实验，以FAZHB-5小球藻为出发菌株，BG11为培养基，100 mL/250mL锥形瓶装液量，转速100 r/min，在二氧化碳培养/振荡培养一体箱中12 h光照/24 h培养4 d，考察二氧化碳不同浓度对小球藻生长的影响。

采用单因素实验，以FAZHB-5小球藻为出发菌株，2%二氧化碳作为碳源，固定BG11培养基中除硝酸钠以外其他成分，100 mL/250 mL锥形瓶装液量，转速100 r/min，在二氧化碳培养/振荡培养一体箱中12 h光照/24 h培养4 d，观察不同硝酸钠加入量对菌体生长影响。

1.3.3 培养基以及均匀设计

BG11培养基（g/L）：NaNO31.5，K2HPO40.04，MgSO4·7H2O 0.075，CaCl2·2H2O 0.036，柠檬酸0.006，柠檬酸铁铵0.006，EDTANa20.001，Na2CO30.02，A51 mL。

A5（痕迹金属，g/L）：H3BO32.86，MnCl2·4H2O 1.86，ZnSO4·7H2O 0.22，Na2MoO4·2H2O 0.39，CuSO4·5H2O 0.08，Co(NO3)2·6H2O 0.05，pH 7.1。

在二氧化碳含量、温度、光照以及培养时间不变，借鉴BG11培养基并参考相关文献[14-20]，采用10因素12水平均匀设计，见表1。依次改变硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁等培养基成分含量，测定不同培养基组成条件下的干菌体质量。

表1 均匀设计要素Table 1 The essential factor for the uniform design

1.3.4 光源选择

设备配备了内置和外置LED光源，白色：10 000 lux；红∶蓝为4∶1的彩光：5 000 lux。

1.3.5 超量氧气去除方法

采用铁质除氧剂吸收过量氧气。

1.3.6 干菌体重量将一定体积的培养液经4 000 r/min离心20 min，弃上清液，收集湿菌体，经80 ℃烘干至恒重，利用精密电子天平称重。

1.3.7 蛋白核小球藻营养成分测定

1.3.7.1 采用全自动凯氏定氮仪检测蛋白核小球藻蛋白质含量 依据GB5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》第一法，将10 mL浓硫酸和1片催化剂（0.5 g硫酸铜和6 g硫酸钾）加入到装有0.5 g蛋白核小球藻粉的消化管中，200 ℃消化1 h，然后420 ℃继续消化1 h；消化液冷却后上机。

1.3.7.2 利用全自动氨基酸分析仪测定氨基酸组成和含量 将50 mg小球藻粉加入到1 mL 6 mol/L盐酸中，110 ℃酸解24 h。取200 μL液体加入535 μL 2 mol/L氢氧化钠中和，用AccQ·Tag Ultra Borate缓冲液稀释2倍。取上述溶液10 uL加入70 μL AccQ·Tag Ultra Borate缓冲液和20 μL AccQ·Tag试剂中，55 ℃加热10 min，冷却后上机。

1.3.7.3 采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定矿物质元素含量 称取25 mg小球藻，加入到装有1 mL硝酸溶液的硝煮管中，沸水蒸煮1 h，加去离子水定容至10 mL，用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定矿物质元素。

光谱条件：低波范围5；高波范围5；最大积分时间30 s；样品冲洗时间30 s；重复次数3；泵延时间 5 s。

1.3.8 蛋白核小球藻青团配方

基础配方（g）：糯米粉150，水晶饺子粉（澄面）50，猪油10，海藻糖 30，水180，豆沙馅250。

2 结果与分析

2.1 碳源对菌体生长影响

自养培养的小球藻，二氧化碳既作为碳源，又是光合作用的底物，其浓度影响着菌体的生长以及淀粉的累积，在一定范围内，光合作用速率随二氧化碳浓度升高而加快，但达到一定浓度后，光合作用速率不再加快，这主要是因为高浓度的二氧化碳易使培养基酸化，抑制了菌体生长。

二氧化碳不同浓度对小球藻生长的影响，实验结果见表2。从表2的结果可以看出，二氧化碳浓度在0.4%到2%区间内，随着二氧化碳浓度提高，小球藻菌体量（以OD值表示）不断提高，但当二氧化碳浓度超过2%后，反而不利用于菌体生长，因此下面的研究中，选择2%浓度二氧化碳作为碳源的最适浓度。

表2 二氧化碳通气量对小球藻生长影响Table 2 Effect of carbon dioxide aeration rate on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.2 氮源对菌体生长影响

小球藻能够利用硝酸盐作为氮源，进行生长，并合成蛋白质、淀粉等[23]，不同硝酸钠加入量对菌体生长的影响，实验结果如表3所示。从表3的结果可以看出，10 g/L的硝酸钠更适合小球藻生长。继续提高硝酸钠的添加量，菌体生长反而受到抑制，其作用机理有待进一步研究。

表3 硝酸钠加入量对小球藻生长影响Table 3 Effect of sodium nitrate addition on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.3 培养基优化

小球藻培养基主要以碳源、氮源和无机盐为主，在以FAZHB-5小球藻为出发菌株，2%二氧化碳作为碳源，100 mL/250 mL锥形瓶装液量，转速100 r/min，在二氧化碳培养/振荡培养一体箱中12 h光照/24 h培养4 d，通过对磷酸氢二钾、硫酸镁、硝酸钠、硫酸钾、柠檬酸铁胺、氯化钙、维生素B1、EDTANa2、钨酸钠、氯化镍进行如表1的10因素12水平均匀实验，获得了优化后的培养基成分，实验设计和结果见表4。

对表4的数据进行二次多项式逐步回归分析，得出拟合线性回归方程如下：

表4 均匀实验设计及结果Table 4 The design and results of uniform experiment

Y=1.3X1+0.006X2+0.2X3+7.0X4+0.01X5+2.0X6+0.01X7+0.001X8+4×10-5X9+ 6×10-5X10，

其中：R2= 0.999 998，F = 159 230 7，P= 0.000 6。

从而可以获得优化后的培养基组成：磷酸氢二钾0.6 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硝酸钠11 g/L，硫酸钾0.8 g/L，柠檬酸铁胺0.006 g/L，氯化钙0.05 g/L，维生素B10.11 g/L，EDTANa20.01 g/L，钨酸钠0.08×10-3g/L，氯化镍0.02×10-3g/L，理论上可以获得8.500 g/L干菌体。

以2%二氧化碳为碳源，按照优化培养基组成，利用密闭的气升式生物反应器为培养装置，在控制无菌二氧化碳进入情况下，气体内部循环，进行3次重复培养，测得菌体干重分别为8.539、8.648和8.407 g/L，基本达到甚至超过优化水平，与模型预测值较接近，说明该回归方程较可靠。

2.4 光源种类和位置对小球藻菌体干重的影响

叶绿素是与光合作用有关的最重要的色素，它可从光中吸收能量，用来将二氧化碳转变为碳水化合物淀粉。叶绿素a、叶绿素b的吸收光谱有两个，分别为波长630～680 nm的红光区和波长为400～460 nm的蓝紫光区[24]。常用的LED白光，本身发出的是450 nm的光，相较于叶绿素所需，红光部分利用率偏低。

实验采用上述优化培养基配方，利用密闭的气升式生物反应器为培养装置，在控制无菌二氧化碳进入情况下，气体内部循环，光源为LED白光（10 000 lux）和红蓝彩光（4∶1，5 000 lux），放置在装置内中心位置和四周位置。通过调整光源种类和位置，考察光源种类和位置对小球藻菌体干重的影响，实验结果如表5所示。

表5 不同光源和位置的光照实验Table 5 Experiments of different light sources and positions

从表5的实验结果可以看出，增加四周光照后，菌体干重比仅有中心光源增加了70%，而中心彩色LED灯的更换，使菌体干重提高了1.8倍，比最初提高了3倍以上，效果非常明显；实验也发现，四周及中心全部采用彩光，菌体干重提高效果并不理想。将来全光谱的LED灯会更好地应用到藻类培养中。

2.5 氧气量对小球藻菌体干重的影响

氧气浓度过高，抑制小球藻生长[25]。如果不加控制，发酵8 d，氧气量最高可到40%左右，因此采用除氧剂吸收过量的氧气。不同氧气浓度对菌体干重的影响如表6所示，从表6的实验结果可以看出，氧气量20%更适合菌体生长，几乎是空气中氧气浓度。氧气量过高或过低都产生抑制，这与文献报道基本一致。

表6 不同氧气量对菌体生长影响Table 6 Effect of different oxygen content on cell growth

2.6 蛋白核小球藻营养成分检测

2.6.1 蛋白核小球藻蛋白质含量测定

根据GB5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》第一法，采用全自动凯氏定氮仪，测得蛋白核小球藻蛋白质含量高达58 g/100g，验证了密闭自养培养方式，可以获得蛋白质含量更高的蛋白核小球藻，这与前人的研究报道一致[26]。

2.6.2 氨基酸含量测定

利用氨基酸测定仪检测了蛋白核小球藻氨基酸含量，结果表明蛋白核小球藻含有丰富的氨基酸，测定结果见表7。

表7 蛋白核小球藻氨基酸含量Table 7 Amino acid content of Chlorella pyrenoidosa

从蛋白质和氨基酸检测结果可以看出，蛋白核小球藻均高于世界卫生组织（WHO）和联合国粮农组织（FAO）颁布的用于人类营养的蛋白质标准，是一种优质蛋白质资源[27]。

2.6.3 蛋白核小球藻矿物质元素含量测定

根据GB5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》，采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）检测该蛋白核小球藻中矿物质的含量。测定结果显示：矿物质元素K、Ca、Mg等含量丰富；重金属Pb、Cr和Cd含量均未超标，符合新资源食品要求，具体结果见表8。

表8 蛋白核小球藻中主要矿物质元素含量Table 8 Main mineral element content in Chlorella pyrenoidosa

2.7 蛋白核小球藻青团制作

根据基础配方，在其它配料用量不变，通过改变蛋白核小球藻的添加量，已经获得了颜色翠绿、不油腻、弹性好、口感好、无碱味等优点的蛋白核小球藻青团。

3 结论

1）单因素优化获得碳源为2%二氧化碳，氮源为10 g/L的硝酸钠；均匀设计获得优化的培养基：磷酸氢二钾0.6 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硝酸钠11 g/L，硫酸钾0.8 g/L，柠檬酸铁胺0.006 g/L，氯化钙0.05 g/L，维生素B10.11 g/L，EDTANa20.01 g/L，钨酸钠0.08×10-3g/L，氯化镍0.02×10-3g/L。

2）实验证明氧气量为20%时，是菌体最适宜的生长环境，LED红蓝4∶1彩光替代白光，有效地弥补了白光中红蓝色的不足，更有利于光合作用进行。

3）蛋白核小球藻粉蛋白质含量高达58 g/100g，同时含有丰富的赖氨酸、胱氨酸、丙氨酸、矿物质元素K、Ca、Mg等。

4）利用获得的蛋白核小球藻，制作了蛋白核小球藻青团，拓展了蛋白核小球藻在食品工业中的应用领域。