林可霉素基因工程研究的新进展

蔡新露 许婉莲 许玉荣 吴杭,* 张部昌

(1 安徽大学 生命科学学院 物质科学与信息技术研究院，合肥 230601；2 合肥师范学院 化学与化学工程学院，合肥 230601)

1962年，Marson等[1]从美国内布拉斯加州林肯市附近的土壤中分离得到了第一株林可链霉菌NRRL2936(Streptomyces lincolnensis NRRL2936)，该菌株产生一种林可酰胺类抗生素—林可霉素A(lincomycin A, Lin-A)(图1)，体内和体外对革兰阳性菌作用均较强，对革兰阴性菌亦有一定的抑制作用。在临床上，林可霉素对由革兰阳性菌引起的疾病，如呼吸道、皮肤及软组织感染等均有良好疗效，也可用于治疗慢性骨髓炎、脑膜炎、泌尿系统革兰阳性菌感染、中耳炎和眼科疾病等，是一种用途极其广泛的抗生素药物[2]。林可霉素A通过与敏感细菌核糖体50S亚基的23S rRNA中心环结合，降低肽基转移酶的活力，使肽链的延伸受阻，从而抑制细菌的蛋白质合成[3]。林可链霉菌发酵过程中除了林可霉素A，还产生其副产物林可霉素B(lincomycin,Lin-B)(图1)。中国药典和美国药典规定，当林可霉素制剂中林可霉素B含量超过5%时[4]，该产品不得作为药物或有效的药剂学成分，因此降低林可霉素B的含量是一个亟须解决的问题。自2017年起，林可霉素野生菌以及高产菌株的基因组测序相继完成[5-6]，这为林可霉素基因工程研究带来了新的机遇。基于近年来该领域诸多的研究进展，笔者简述了林可霉素生物合成及其调控机制，并结合所在实验室的研究工作，对利用基因工程技术进行林可霉素高产工程菌构建和新衍生物创制等方面的进展进行总结和展望，为林可链霉菌的进一步遗传改良及其发酵生产提供参考。

1 林可霉素的生物合成

林可霉素A是由丙基脯氨酸(propyl-L-proline,PPL)和林可酰胺(lincosamide, LSM)通过酰胺键连接，并以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)为甲基供体对丙基脯氨酸N端和林可酰胺末端巯基甲基化修饰而成。Peschke等[7]和Koberska等[8]先后对林可链霉菌78-11和ATCC25466的林可霉素生物合成基因簇(lincomycin biosynthetic gene cluster, lmb cluster)进行测序，发现lmb基因簇含25个结构基因、3个抗性基因和1个调节基因lmbU(图2)。迄今为止，林可霉素生物合成途径已被研究得非常清楚[9-11]。

在PPL的生物合成中，LmbB2首先与辅因子共同作用于酪氨酸[12]，使之羟基化，形成多巴[13]。LmbB1使多巴2和3位碳上的氢键断裂、氧化，并内部环化形成脯氨酸双氢丙酮酸[14-16]。C-甲基转移酶LmbW作用脯氨酸C4位支链，是造成林可霉素A和B差异的关键点[4]。LmbA将谷氨酸转移至底物中，致使草酸盐裂解，形成脯氨酸双氢乙烷，随后LmbX使双键发生转移，经LmbY作用对含氮五元环内和环外的两个双键依次还原，形成PPL[16]。

磷酸果糖或7-磷酸景天庚酮糖和5-磷酸-D-核糖在转醇醛酶LmbR作用下发生缩合，异构化后形成稳定的8-磷酸辛糖，LmbP对其C1位的羟基磷酸化后生成二磷酸辛糖[17]，LmbK水解二磷酸辛糖的C8上的磷酸基团，经LmbO作用转化为GDP-辛糖[18]，随后LmbM、LmbZ、LmbM和LmbS依次参与C6异构、脱水、C4异构和转氨反应，最终生成GDP-LSM[10]。

林可酰胺与丙基脯氨酸的缩合过程较为独特，需要转化为活性形式参与缩合。PPL经LmbC活化为PPL-AMP，而LSM的活化需要一种小分子硫醇麦角硫因(ergothioneine, EGT)和转移酶LmbT参与，生成EGTLSM，后由LmbD催化，在LmbN上缩合形成PPLLSM-EGT复合物，随后，与另一种小分子硫醇放线硫醇(mycothiol, MSH)发生硫醇交换，生成PPL-LSMS-MSH，该反应使得目的产物获得了硫元素[19-20]。PPL-LSM-S-MSH在酰胺酶作用下发生水解反应，释放MSH中的氨基葡萄糖肌醇[19,21]，LmbJ修饰丙基脯氨酸中吡咯环的氮元素，使之甲基化[22-23]，LmbF断裂S-C键，生成去甲基林可霉素[24]，LmbG对巯基甲基化，最终形成林可霉素A[24-25]。

2 林可霉素生物合成的分子调控

近年来，林可霉素生物合成的分子调控有了很大进展。侯兵兵等[26]发现LmbU不仅可以直接激活PPL相关基因lmbA、lmbC、lmbJ和lmbW的转录，还间接抑制LSM相关基因lmbK及其自身的转录；通过蛋白截短等实验证实LmbU的N段为自我抑制结构域(auto-inhibitory domain, AID)，C端为一个未知结构域，在蛋白中央还含有一个DNA结合结构域(DNAbinding domain, DBD)；经氨基酸点突变确定LmbU的第12位半胱氨酸是其形成同源二聚体的关键位点[27]。林春燕等[28]基于RNA测序分析，发现LmbU激活19种林可霉素合成基因簇外基因的表达，并通过抑制羟苯丙酮酸双加氧酶HdpA的基因转录加速PPL的生物合成。林可链霉菌中全局调控子BldA通过控制含TTA密码子基因如结构基因lmbB2和调控基因lmbU的翻译，调控林可霉素生物合成和菌株形态分化[29]。另一种全局调控子AdpA既可激活簇内结构基因、抗性基因和调控基因的转录，还能够促进bldA的表达，正向调控林可霉素的生物合成[30]。近期，侯兵兵等[31]发现了一个氧化还原感应调控因子Rexlin，在林可链霉菌NRRL 2936中敲除该基因，突变株的生长速率提高，而产量却有所降低；并证实Rexlin间接促进簇内结构基因和调控基因的转录影响林可霉素的产量。

在抗生素合成过程中，添加一定量的硝酸盐可影响抗生素产生菌的初级代谢，从而提高抗生素产量，这就是“硝酸盐效应”，而同样现象也出现在林可链霉菌中[32]。孟思童等[5]对氮代谢全局性调控因子GlnR进行了研究，结果发现硝酸盐特异性转运蛋白将硝酸盐内运至细胞内诱导glnR的高效表达，GlnR进而促进该转运蛋白基因的转录，以加速菌体内硝酸盐浓度的进一步提高；GlnR通过提高硝酸盐同化途径相关基因的转录水平，可提升细胞内谷氨酸的水平，而谷氨酸经转氨作用可形成林可霉素合成前体酪氨酸；同时，GlnR还可直接正调控抗性基因lmrA的转录表达，促进林可霉素的外排并提高菌株的抗性。

本实验室发现了与林可霉素生物合成相关的3种转录调控因子(SLCG_2919、BldD和SLCG_Lrp)。TetR家族调控子SLCG_2919可直接抑制林可霉素合成基因簇以及邻近基因SLCG_2920的转录，从而负调控林可霉素的生物合成[33]。林可链霉菌BldD作为一个重要的发育调控因子，直接正调控林可霉素的生物合成[34]。亮氨酸应答调控蛋白SLCG_Lrp一方面直接促进林可霉素合成基因簇中部分结构基因、全部3个抗性基因和调控基因lmbU的转录，另一方面直接抑制自身基因并激活邻近基因SLCG_3127的转录。此外，SLCG_Lrp还受到SLCG_2919直接的转录调控作用[35]。本文基于上述研究结果绘制了林可霉素生物合成的局部调控网络(图3)。

3 林可霉素产量与纯度的提高

3.1 增加胞内硝酸盐浓度

在林可霉素发酵过程中，添加一定浓度的硝酸盐可以使其产量明显提高。孟思童等[5]发现了一种硝酸盐特异性ABC转运蛋白ABC2，它可以内运硝酸盐，使胞内硝酸盐浓度提高，从而增加林可霉素产量。已有研究报道亚硝酸盐特异性内运蛋白NirC在克氏杆菌DSM 10542[36](Sanguibacter keddieiiDSM 10542)、暗地嗜皮菌DSM 43160[37](Geodermatophilus obscurusDSM 43160)和地中海拟无枝酸菌U-32[38](Amycolatopsis mediteraneiU-32)等多种菌中均参与氮代谢。在林可霉素高产菌LC-G中共表达ABC2和nirC，胞内硝酸盐浓度升高，GlnR高效表达，致使林可霉素产量大幅提高[5]。

3.2 调控与抗性基因改造

侯兵兵等[26]在解析LmbU调控机制的基础上，于野生菌NRRL2936中过表达该基因， 林可霉素产量提升了5倍。本实验室在林可霉素高产菌株LA219X中敲除SLCG_2919或增加SLCG_Lrp基因拷贝数，可使林可霉素A产量分别提高15%和14%[33,35]。另外在林可霉素高产菌株LC-G中过表达抗性基因lmrC，可增加菌株对林可霉素的耐受力[39]，而杜磊等[40]利用将含抗性基因lmrA、lmrB和lmrC的多拷贝质粒和整合质粒依次转入林可霉素野生菌ATCC25466中，林可霉素A产量先后提高了52.9%和38.3%。

3.3 代谢前体基因及结构基因改造

林可霉素生物合成基因簇中存在3个依赖SAM的甲基转移酶基因(lmbW、lmbJ和lmbG)，说明在林可霉素合成过程中甲基的供给必不可少。一般来说，SAM是由metK编码的多数甲基化反应的唯一甲基供体[41]。逄爱萍等[4]根据已报道的链霉菌metK序列设计兼并引物，PCR扩增得到林可链霉菌的metK基因，在林可链霉菌SyBE2901中共表达该基因和lmbW，林可霉素A产量达到1744.6 mg/L，较出发菌株提高了35.83%，林可霉素B含量由6.76%降至4.41%。笔者实验室在林可霉素高产菌株LC-G中发现了两个metK同源基因metK1和metK2，并在高产菌株LCGL和LA219X中共表达metK1和metK2，林可霉素A产量分别提高了27%和17%[42]。

L-多巴既可作为双加氧酶LmbB1的底物用于合成林可霉素，也可作为黑色素前体被酪氨酸酶作用。在林可链霉菌中过表达lmbB1，摇瓶发酵时林可霉素A产量提高不显著，但副产物林可霉素B和黑色素的合成被抑制；而15L发酵罐发酵时林可霉素A的产量提高了37.6%，林可霉素B和黑色素分别降低了73.4%和29.9%[43]。

本文基于上述研究结果汇总了林可霉素高产菌株基因工程改造的实例(表1)。

表1 林可霉素高产菌的基因工程改造Tab.1 Genetic engineering of lincomycin overproducing strains

4 新型林可霉素衍生物的创制

林可霉素衍生物，如克林霉素具有极大的药用价值，是少数几个在临床上用于治疗革兰阴性厌氧菌的药物之一。然而，传统的化学合成法提取过程繁琐且污染严重。因此，亟需一些有效的方法用于合成林可霉素衍生物。目前已报道使用生物催化或微生物发酵法合成林可霉素衍生物。

天青链霉菌(Streptomyces azureus)磷酸吡哆醛依赖酶CcbF和林可链霉菌LmbF同源性高达40%，它们以不同的方式作用底物，并与下游酶共同催化，使各自的产物天青菌素和林可霉素A具有独特硫功能化，CcbF行使双功能酶的职能，既脱羧又氧化脱氨；LmbF负责β消除，断裂C-S键[24]。在体外，这两种硫功能化过程可以交叉使用，王敏等[24]以此为基础，整合已知的酶功能，在体外合成了多种新的林可酰胺类抗生素。

研究发现对林可霉素及其衍生物中脯氨酸烷基链长度和结构的修饰可能影响其抗菌活性[16]，Dana等[44]在林可链霉菌中敲除lmbX致使其无法产生林可霉素，通过回补实验证明这是由于林可霉素前体4-丙基脯氨酸的合成被阻断；在ΔlmbX突变株发酵液中添加前体衍生物丁基脯氨酸和戊基脯氨酸，可产生高浓度的4-丁基-4-去丙基林可霉素和4-戊基-4-去戊基林可霉素，它们在抗葡萄球菌方面比林可霉素更加有效。

Janata等[45]基于对天青菌素生物合成中关键酶的机制解析，使用酶催化方法制备了数百种林可霉素衍生物，并发现对其结构中MTL的C1位引入烷基水杨酸酯或PPL的C4′位引入碳长为4-6的烷基，可提高林可霉素衍生物的抗菌活性。

5 总结与展望

林可霉素类药物作为高效抗生素已被广泛应用于畜禽兽医临床方面，具有较大的市场份额。我国是林可霉素发酵生产的大国，但面临发酵效价偏低、组分复杂等问题。目前林可霉素生物合成途径已经非常清晰，其异源双相前体凸显了林可霉素合成代谢通路的多样性，这为林可霉素高品质育种奠定重要基础。尽管通过林可链霉菌基因工程改造优产林可霉素已有一些报道，但相对于其他链霉菌还略有不足。近年来，除了林可霉素野生菌NRRL2936，迄今有两株林可霉素高产菌的全基因组被测序完成[5-6]。王瑞达等[6]基于比较基因组分析，在高产菌B48中初步发现了影响其林可霉素产量的关键因素，其中基因调控对林可霉素菌种的高产至关重要，这为林可链霉菌系统的代谢工程改造提供理论依据。纵观已有林可霉素生物合成调控的研究进展，其已然呈现出多元的分子机制，这进一步凸显了林可霉素合成调控的复杂性。而功能基因组学[46-48]、指数富集的配体基因组系统进化技术[49]、DNA亲和捕获实验[50-51]等系统生物学方法的应用，将有助于深化对林可霉素合成代谢调控网络的认识。在此基础上，运用合成生物学的理念，通过关键调控元件设计与优化及其分子网络的重塑，将有助于显著提升林可霉素的微生物制造水平。

虽然近年来林可霉素基因工程研究进展较快，但仍有一些问题亟待解决。通过基因工程手段改造林可霉素工业菌株，如何进一步降低林可霉素B等副产物或杂质的含量？工业菌株在多次传代和发酵过程中如何稳定优产性能？如何定向并高效创制更多优效的林可霉素衍生物？怎样做到林可霉素基因工程菌与现有发酵工艺的高效匹配？解决这些问题，将为深入理解林可霉素生物合成代谢及其调控的复杂机制，以及工业菌株的高效精准与系统工程改造奠定基础。