藏红花素通过Nrf2/HO-1通路减轻大鼠肺缺血再灌注损伤的实验研究*

石俊杰 宁改丽 石一民

（河北省邯郸市第一医院，河北 邯郸 056000）

肺缺血再灌注（LIR）损伤常继发于肺溶栓、肺袖状切除术、肺移植手术等治疗过程，是导致患者预后不佳的重要因素。LIR损伤是非常复杂的病理生理过程，其中氧化应激和炎症反应发挥着重要作用[1]。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1（Nrf2/HO-1）是氧化应激反应的关键信号通路，并且能够调控核因子-κB（NF-κB）表达与活化参与炎症反应过程[2-3]。有研究发现激活Nrf2/HO-1通路能够明显减轻大鼠LIR 损伤[4]。

藏红花属于鸢尾科番红花属球茎草本植物，其干燥柱头为名贵中药材，具有活血化瘀、凉血解毒、散郁开结等功效，常用于忧思郁结、胸膈痞闷、产后瘀血腹痛等症的治疗[5]。藏红花素为中药藏红花的主要活性成分之一，是一种罕见的水溶性类胡萝卜素，具有良好的抗氧化、抗炎活性[6]。有研究发现藏红花素能够激活Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激、炎症、细胞凋亡而减轻三氧化二砷所致心脏损伤[7]。本研究旨在探讨藏红花素对大鼠LIR损伤的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 80只清洁级健康雄性SD大鼠，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2018-004，8周龄，体质量220～260 g。清洁环境饲养：室温23～25℃、相对湿度50%～60%、昼夜明暗交替。本研究获得邯郸市第一医院动物伦理委员会审查批准。

1.2 药物与试剂 藏红花素购自美国Sigma公司；Brusatol（Nrf2抑制剂）购自美国MCE公司；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒购自美国R&D公司；Nrf2、HO-1抗体购自北京博奥森生物科技有限公司；NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗体购自美国Abcam公司；ECL化学发光液购自美国Millipore公司。

1.3 实验仪器 DH-150型动物呼吸机（浙江大学医学仪器有限公司）；Premier 3000型血气分析仪（美国GEM公司）；DU640型分光光度计（美国Beckman公司）；HM355S型石蜡切片机、1410101型酶标仪、UVP型凝胶成像系统（美国Thermo Scientific公司）；Power-Pac型电泳仪（美国BioRad公司）、VE-186型转膜仪（上海天能科技有限公司）。

1.4 分组与给药 按随机数字表法将80只大鼠分为4组：假手术组、模型组、藏红花素组、藏红花素+Brusatol组，各20只。造模前30 min，藏红花素组15 mg/kg腹腔注射[8]，藏红花素+Brusatol组予藏红花素 15 mg/kg、Brusatol 2 mg/kg腹腔注射[9]，假手术组和模型组腹腔注射生理盐水，各组给药体积均为5 mL/kg。

1.5 模型制备 除假手术组外，其他组均参照文献[10]制备LIR大鼠模型。麻醉后取仰卧位，切开气管并插管，连接动物呼吸机（呼吸频率70次/min，呼吸比2∶1，潮气量10 mL/kg），500 U/kg尾静脉注射肝素钠，左侧第5肋间开胸，夹闭左肺门使左肺缺血，左肺不再膨胀、由淡红色变为暗紫红色，表明阻断成功。1 h后松开动脉夹，左肺逐渐膨胀、暗紫红色逐渐恢复淡红色，表明再灌注成功。假手术组行相同的手术通路，但不阻断左肺门。

1.6 标本采集与检测 1）动脉血氧分压（PaO2）、氧合指数（OI）检测：再灌注24 h后，各组随机取10只大鼠，经股动脉取血2 mL，通过血气分析仪检测PaO2，OI=PaO2/吸入氧浓度（本实验吸入空气，氧浓度为0.21）。2）肺组织病理学改变及病理评分：麻醉后颈椎脱臼处死，开胸取左肺组织，切取约1 cm3组织块，置于4%多聚甲醛溶液固定72 h，行石蜡包埋、5 μm厚度切片、HE染色后，通过光学显微镜观察肺组织病理学改变。分别从肺水肿、肺泡及间质区炎症、出血、肺不张、透明膜形成共5个方面进行病理评分[11]：400倍光学显微镜下，视野内未见病变记0分，病变面积占视野＜25%记1分、25%～50%记2分、50%～75%记3分、＞75%记4分，5个方面评分之和即为病理评分。3）肺组织SOD、CAT、MPO活性和MDA含量：取左肺组织100 mg，研磨匀浆后，4℃、3 000 r/min离心5 min取上清液，通过分光光度计检测SOD、CAT、MPO活性和MDA含量。4）ELISA法检测肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β水平：再灌注24 h后，取各组剩余的10只大鼠，麻醉后气管插管，采用注射器向气管内缓慢注入3 mL磷酸盐缓冲液行肺泡灌洗后抽回灌洗液，共灌洗3次，4℃、3 000 r/min离心10 min取上清液，按照ELISA试剂盒说明检测TNF-α、IL-1β 水平。5）肺组织 Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达检测：颈椎脱臼处死，开胸取左肺组织100 mg，剪碎后加入4℃裂解液、冰上静置30 min，4℃、12 000 r/min离心20 min取上清液，BCA法测定蛋白浓度后，SDS-PAGE电泳分离蛋白、转PDVF膜、室温封闭 1.5 h后，加 Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗体4℃孵育12 h，洗膜后加IgG二抗室温孵育1 h，ECL显影并通过Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白与β-actin条带灰度值的比值作为目标蛋白相对表达量。

1.7 统计学处理 运用SPSS 17.0进行数据统计分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，多组间比较行单因素方差分析，方差齐时两组间比较采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett′s T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠动脉血PaO2、OI水平及肺组织病理评分比较 见表1。与假手术组比较，模型组动脉血PaO2、OI降低（P＜0.05）；与模型组比较，藏红花素组PaO2、OI升高（P＜0.05）；与藏红花素组比较，藏红花素+Brusatol组PaO2、OI降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠动脉血PaO2、OI及肺组织病理评分的比较（±s）

表1 各组大鼠动脉血PaO2、OI及肺组织病理评分的比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与藏红花素组比较，△P＜0.05。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

组别n PaO2（mmHg）OI 病理评分（分）假手术组模型组藏红花素组藏红花素+Brusatol组10 10 10 10 87.25±11.94 54.08±9.13*82.76±11.42#62.35±10.67△414.96±35.72 259.14±30.27*392.57±36.08#297.43±33.59△0.50±0.10 16.20±2.30*4.30±0.60#14.50±2.10△

2.2 各组大鼠肺组织病理学改变及病理评分的比较 见图1，表1。假手术组大鼠肺组织结构清晰、完整，肺泡未见渗液，间质区未见水肿及炎性细胞浸润；模型组可见肺组织结构紊乱，肺泡破裂融合、有渗液，间质区水肿、炎性细胞大量浸润等病理学改变；与模型组比较，藏红花素组肺组织上述病理学改变明显减轻；与藏红花素组比较，藏红花素+Brusatol组肺泡破裂渗液、间质区水肿及炎性浸润等病理学改变明显加重。与假手术组比较，模型组肺组织病理评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，藏红花素组病理评分降低（P＜0.05）；与藏红花素组比较，藏红花素+Brusatol组病理评分升高（P＜0.05）。

图1 各组大鼠肺组织病理学改变（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠肺组织SOD、CAT、MPO活性和MDA含量比较 见表2。与假手术组比较，模型组SOD、CAT活性降低，MPO活性和MDA含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，藏红花素组SOD、CAT活性升高，MPO活性和MDA含量降低（P＜0.05）；与藏红花素组比较，藏红花素+Brusatol组SOD、CAT活性降低，MPO活性和MDA含量升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠肺组织SOD、CAT、MPO活性和MDA含量比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织SOD、CAT、MPO活性和MDA含量比较（±s）

组别假手术组模型组藏红花素组藏红花素+Brusatol组n 10 10 10 10 SOD（U/mg）107.53±12.68 62.95±8.41*98.16±12.07#71.48±9.15△CAT（U/mg）79.56±10.24 43.27±6.09*71.52±9.83#50.46±7.24△MPO（U/mg）6.15±0.87 11.48±1.53*6.49±0.91#10.36±1.64△MDA（nmol/mg）3.92±0.46 7.64±1.15*4.59±0.63#6.68±1.02△

2.4 各组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平比较 见表3。与假手术组比较，模型组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，藏红花素组TNF-α、IL-1β水平降低（P＜0.05）；与藏红花素组比较，藏红花素+Brusatol组TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平比较（ng/L，±s）

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平比较（ng/L，±s）

组 别n TNF-αIL-1β假手术组模型组藏红花素组藏红花素+Brusatol组10 10 10 10 74.95±13.06 186.73±25.41*90.48±16.72#151.36±23.94△113.84±15.29 307.24±48.63*153.92±20.71#260.85±39.13△

2.5 各组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达的比较 见图2，表4。与假手术组比较，模型组肺组织Nrf2、HO-1表达量降低，p-NF-κB p65表达量和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高（P＜0.05）；与模型组比较，藏红花素组Nrf2、HO-1表达量升高，p-NF-κB p65表达量和 p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低（P＜0.05）；与藏红花素组比较，藏红花素+Brusatol组 Nrf2、HO-1表达量降低，p-NF-κB p65表达量和 p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

表4 各组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达的比较（±s）

表4 各组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达的比较（±s）

组别假手术组模型组藏红花素组藏红花素+Brusatol组n 10 10 10 10 Nrf2 1.07±0.12 0.14±0.03*0.95±0.11#0.28±0.05△HO-1 0.82±0.11 0.13±0.02*0.57±0.08#0.21±0.04△NF-κBp65 0.65±0.09 0.68±0.10*0.62±0.08#0.67±0.09△p-NF-κBp65 0.04±0.01 0.48±0.07*0.09±0.02#0.37±0.05△p-NF-κBp65/NF-κBp65 0.06±0.02 0.71±0.14*0.15±0.03#0.56±0.09△

3 讨论

肺脏是机体血流高灌注器官之一，对缺血及再灌注损伤非常敏感，防治LIR损伤一直是医学研究的热点。夹闭左肺门45～60 min制备的LIR大鼠模型与人类临床病理相似，是普遍认可的LIR动物模型制备方法。本研究发现，藏红花素预处理能够明显提高LIR大鼠动脉血PaO2、OI水平，改善肺组织病变并降低病理评分，提示藏红花素能够减轻LIR大鼠肺组织损伤、改善LIR大鼠肺功能。

组织缺血及再灌注过程线粒体呼吸电子传递链受阻、黄嘌呤脱氢酶转换成黄嘌呤氧化酶增多等导致ROS大量生成，超过SOD、CAT等组成的内源性抗氧化酶体系的抗氧化能力，导致ROS不能及时被清除而攻击生物膜、核酸、蛋白质等生物大分子，造成氧化应激损伤[12]。LIR导致中性粒细胞聚集并释放炎症因子，其中TNF-α、IL-1β除了能够诱发机体炎症反应外，还能趋化中性粒细胞等进一步释放炎症因子而加重炎症反应。MPO属于血红素过氧化物酶超家族成员，能够催化生成氧化剂而引发氧化应激损伤，并且MPO能够间接诱导中性粒细胞聚集而加重炎症反应[13]。本研究发现，藏红花素预处理能够明显提高LIR大鼠肺组织SOD、CAT活性并降低MPO活性、MDA含量，降低肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平，提示藏红花素能够抑制LIR大鼠肺组织氧化应激和炎症反应。

正常生理状态下，定位于细胞质中的抗氧化核转录因子Nrf2与Keap1形成复合物而无活性。氧化应激损伤等病理性刺激能够促进“Nrf2-Keap1”解离，游离状态Nrf2核转位后与抗氧化反应元件序列结合，诱导SOD、CAT等抗氧化酶转录表达，提高ROS清除能力[14]。HO-1是Nrf2的下游信号蛋白，能够催化血红素降解，其降解产物胆绿素具有较强的抗氧化活性，是内源性抗氧化剂[15]。NF-κB是一种由p50/p65二聚体形成的核转录因子，组织缺血再灌注等病理状态能够诱导NF-κB磷酸化而活化，核转位后p-NF-κB p65亚基能够与特异性位点结合而诱导炎性因子转录表达，加重炎症反应。卢晓郎等[16]发现HO-1能够抑制NF-κB活化与核转位。本研究发现，藏红花素预处理能够明显提高LIR大鼠肺组织Nrf2、HO-1表达量，降低p-NF-κB p65表达量，降低p-NF-κB p65/NF-κB p65比值；Nrf2抑制剂Brusatol能够明显逆转藏红花素对LIR大鼠肺组织Nrf2、HO-1、p-NF-κB p65表达的调控作用以及对肺组织损伤的保护作用；提示藏红花素对LIR大鼠肺组织氧化应激和炎症反应的抑制作用，可能与其激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB活化有关。

综上所述，藏红花素能够抑制LIR大鼠氧化应激和炎症反应，减轻LIR损伤，改善肺功能，其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB活化有关。LIR损伤病理机制复杂，本课题组将进一步探讨藏红花素对LIR损伤的作用机制。