一例猪细小病毒2型和3型混合感染的实验室诊断

拉马甲甲，张 阳，徐志文*

（1.四川省喜德县农业农村局，四川 喜德 616750；2.四川农业大学动物医学院，动物疾病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130）

猪细小病毒病（PPI）会导致猪只繁殖功能障碍、消化和呼吸系统疾病，是由猪细小病毒（PPV）感染引起的。目前，细小病毒分为经典的猪细小病毒1 型（PPV1）以及近几年陆续发现的2～7 型（PPV2～7）等新型细小病毒［1］。其中，PPV1、PPV2 和PPV3 在我国广泛分布，且常与其他病原混合感染，对我国养殖业危害极大。猪细小病毒感染常发于初产母猪，表现为流产、木乃伊胎以及病弱胎，而母猪本身并无明显症状［2］。仔猪感染后可导致生长受阻，同时还会造成炎症疾病［3］。猪细小病毒具有很强的传染性，既可通过生育垂直传播，也可通过口鼻水平传播，一旦病毒传入，几个月内便可感染所有健康猪群，而感染后的猪可长时间带毒排毒，难于控制，严重危害养猪业的正常发展。

四川省凉山州某规模化猪场的初产母猪出现流产、产弱仔和死胎的情况，据了解，该场曾有过细小病毒、圆环病毒2 型和蓝耳病发病史。为探明发病原因，本试验采集了病死猪病料进行实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 病料来源 病料采集于四川省凉山州某规模化猪场死胎仔猪的心包积液、新鲜肺脏、肝脏及淋巴结。

1.2 试剂 TSA 培养基，DL2000 DNA Marker，ddH2O，Trizol 细胞裂解液，PrimeScriptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒，2×Taq MasterMix，通用型基因组DNA提取试剂盒。

1.3 细菌学检测 在超净台内用接种环无菌蘸取死胎仔猪的心包积液、肝脏组织病料接种于TSA 培养基上，于37 ℃恒温培养箱中培养，隔天观察菌落生长情况。

1.4 病毒检测

1.4.1 引物设计及合成 根据GenBank 已登录的PRRSV、PCV2、PPV1、PPV2、PPV3 的基因序列，利用Oligo 7 软件设计引物（表1）。

表1 引物信息

1.4.2 病料DNA/RNA的抽提及RNA的反转录 剖解仔猪，取淋巴结、肝脏、肺脏，加适量PBS 和钢珠于EP 管中，放入冷冻型组织研磨器，于60 Hz 4 ℃研磨10 min，反复冻融3 次后离心取上清液（12 000 r/min，10 min）。利用通用型基因组DNA提取试剂盒进行病料DNA的抽提。采用Trizol法进行病料RNA的抽提。抽提完的病料RNA使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 进行反转录，获得病料的cDNA。

1.4.3 PCR 扩增检测 50 μL 反应体系：2×Taq MasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL；DNA/cDNA 各1 μL，RNase-Free H2O 20 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 细菌学检查 经过37 ℃恒温培养24 h 的平板无菌落生长，表明无细菌感染。

2.2 病毒检测 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，PPV2和PPV3分别扩增出500 bp左右（见图1）和200 bp 左右（见图2）的目的条带，与预期片段大小相符，而PCV2（见图3）、PPV1（见图4）和PRRSV（见图5）并未扩增出任何条带。阴性和阳性对照均成立。结合发病情况及PCR检测结果，判断该病例为PPV2和PPV3的混合感染。

图1 PPV2 PCR检测结果

图2 PPV3 PCR检测结果

图3 PCV2 PCR检测结果

图4 PPV1 PCR检测结果

图5 PRRSV RT-PCR检测结果

3 讨论

细小病毒在自然界中普遍存在，侵染宿主范围广泛，涉及脊椎动物、无脊椎动物及人类。目前为止，能感染猪的细小病毒共有7 种，即猪细小病毒1～7 型。其中，PPV1 造成的危害最为严重，是猪场管理中重点防范的病原之一，而其余分型却较少关注。有文献指出，PPV2 和PPV3 在我国的流行程度不亚于PPV1，这提示我们广泛的PPV2 和PPV3 感染可能会对养猪业造成潜在的危害［4］。

猪细小病毒于世界各地分布，给养猪业造成了极大损失。目前尚无针对猪细小病毒的特效抗病毒药物，对猪细小病毒的控制也主要以预防为主。便捷、灵敏、特异的检测方法能帮助猪场更好地控制猪细小病毒的传播。PCR 技术自提出已经过几十年快速发展，并衍生出了实时荧光定量PCR、原位PCR、RT-RAA 等技术。但传统的PCR 技术仍是目前兽医诊断的基础技术，并广泛用于各种疾病的基础诊断。针对不同疾病设计出特异性引物，结合自动核酸提取仪，可在2 h内完成全部检测，且具有较高的特异性和灵敏性。

本案例中，我们首先了解到该猪场的发病情况主要为母猪流产、产死胎，并且该场曾有过细小病毒、蓝耳病毒和圆环病毒发病史，于是我们推断此次发病可能是该猪场消毒未到位而导致的病毒感染。通过细菌检测，结果也证实了并不是细菌导致的流产。PCR结果显示，该猪场发病为PPV2 及PPV3 混合感染导致的。猪细小病毒主要引起母猪的繁殖障碍多发于8～10 月，患病母猪多无临床症状，难以提前治疗。有研究指出，PPV2 常与PCV2 混合感染，导致猪只出现猪呼吸道病复合体，最后因肺炎而死亡［5］。制定科学的免疫计划，做好定期消毒工作，减少病毒的继发感染，阻断病原微生物的感染与传播，是保障猪场正常运转的根本措施。■