参芍口服液对急性心肌梗死大鼠的心肌保护作用分析

刘 帆，邸亚丽，马 威，李 霞，杨立明，亢小丽，郭 月，纪 征

急性心肌梗死(AMI)指急性发作的冠状动脉缺血缺氧导致心肌坏死，临床表现以胸骨后或心前区剧烈的压榨性疼痛为主，服用硝酸甘油无法缓解，严重者可发展为心力衰竭，危及生命[1]。我国AMI发病率逐年上升，1987—2014年AMI相关死亡人数增加了5.6倍[2]。再灌注治疗能及时挽救受损心肌，是AMI首选治疗方式[3]，但治疗时间窗极大限制了其临床应用。既往西药在逆转心肌损伤方面的效果不理想，因此亟须寻找治疗AMI的新药。中医药用于AMI治疗历史悠久，参芍口服液主要成分包括丹参、黄芪、当归、赤芍、川芎等，具有活血化瘀、调气养血等功效，临床已用于治疗冠心病、心绞痛。薛忠文等[4]发现参芍口服液治疗冠状动脉粥样硬化效果显著；贾春新等[5]发现参芍口服液可抑制糖尿病大鼠肝脏氧化应激，对肝脏具有保护作用，但其是否对AMI造成的心肌损伤具有积极作用，尚无确切证据。Wnt/β-catenin信号通路是一种多元复杂的级联放大信号通路，参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多个病理生理过程。本研究通过制备AMI大鼠模型，从分子生物学角度，基于Wnt/β-catenin信号通路研究参芍口服液对AMI的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 65只雄性SPF级SD大鼠，8周龄，体质量(250.3±25.1)g，购于解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心，实验动物许可证号：SCXK-(军)2009-003。

1.2药物与试剂 参芍口服液(唐山工人医院制药室，批准文号Z20050957)，贝那普利片(成都地奥制药集团有限公司，国药准字H20053390)。白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，Wnt10b、β-catenin兔抗鼠多克隆一抗工作液(美国Abcam公司)，DAB显色液(福州莱博生物技术有限公司)，SP免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1动物模型制备及药物干预：随机选取10只大鼠作为假手术组，其余建立AMI模型。将造模成功大鼠随机分为模型组及低、中、高剂量参芍口服液组和阳性对照组。大鼠适应性喂养1周后，按文献[6]方法复制AMI大鼠模型，术前12 h禁食，10%水合氯醛麻醉后，固定于手术台上，四肢插入心电图电极，连接Powerlab数据采集分析系统。采用小动物呼吸机以10 ml潮气量行人工通气，95/min，常规备皮、消毒后于左侧第三肋间开胸暴露心脏，在冠状动脉左前降支距左心耳起始处2～3 mm处结扎，当结扎部位心肌组织由鲜红色变成暗红色甚至苍白，心电图示ST段弓背向上性抬高，视为造模成功，后逐层缝合伤口。假手术组开胸后不予结扎。手术均在无菌条件下进行。术后大鼠死亡5只，造模成功大鼠随机分为5组，每组10只。术后1 d开始药物干预，低、中、高剂量参芍口服液组分别给予3.2、6.4、12.8 ml/kg参芍口服液灌胃，阳性对照组予贝那普利10 mg/(kg·d)灌胃[7]，假手术组和模型组大鼠予等体积生理盐水灌胃，每日1次，持续4周。末次治疗1 h后行超声心动图评估左心室功能；取腹主动脉血离心取血清用于生化指标和ELISA试剂盒检测；处死后取梗死心肌组织，一部分固定于4%多聚甲醛中，其余部分保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2心功能评估：末次治疗1 h后，所有大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，行超声心动图测量左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)。采用全自动生化仪检测大鼠血清肌酸激酶(CK)、心肌型肌酸激酶同工酶(CK-MB)、脑钠肽(BNP)水平。

1.3.3心肌组织HE染色：大鼠梗死心肌组织于4%多聚甲醛中固定72 h后，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋制成蜡块后切片，经梯度乙醇脱蜡至水后，行苏木素染色、浸入盐酸乙醇，再用自来水冲洗载玻片，至核变为蓝色，再依次放入95%乙醇2 min、伊红1 min染色，经梯度乙醇脱水透明后封片，在光学显微镜下观察心肌组织病理学变化。

1.3.4ELISA检测炎性因子：采用ELISA试剂盒检测大鼠外周血炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，实验步骤严格按照试剂盒说明书要求操作。

1.3.5免疫组织化学染色检测Wnt10b、β-catenin蛋白表达：石蜡切片常规脱蜡后，1%TritonX-100 4 ℃过夜，3%甲醇+30%过氧化氢室温孵育15 min，PBS液洗涤3次，应用沸腾的枸橼酸缓冲液进行抗原修复，PBS液洗涤3次，用5%牛血清白蛋白37 ℃封闭30 min，孵育一抗4 ℃过夜，PBS液洗涤3次，37 ℃孵育二抗30 min，PBS液洗涤3次，DAB显色，清洗后复染、封片。光学显微镜下观察染色结果，染色呈棕黄色即为阳性表达。200倍光学显微镜下取6个高倍视野照相，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析，计算指定区域面积及该区域内部特定染色部分的累积光密度，从而得出该区域内特定染色物的平均光密度。

1.3.6Western blot检测Wnt10b、β-catenin蛋白表达：将大鼠心肌组织加入裂解液行冰上匀浆，离心取上清，BCA法行蛋白定量，100 ℃水浴变性。提前配置分离胶和浓缩胶，凝固后插入齿梳，加入足够的电泳缓冲液后上样电泳，300 mA转膜。条带在5%脱脂牛奶中摇床封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗3次，室温孵育二抗2 h，TBST洗3次，ECL显色，在凝胶成像仪中拍摄条带图片并分析灰度值。

正常杵状棘突在腰椎屈伸时末端会有明显前后位移，被认为是疼痛根源［4］，但该患者腰部屈伸时无杵状棘突明显位移。右L4/L5关节突关节区疼痛及肌肉紧张的原因行腰椎CT平扫及三维重建进一步检查。CT示L5右侧峡部裂（图2a），L5右半椎板、下关节突及杵状棘突与L5其他骨结构分离，形成浮动半椎板，恰如浮动膝［5］或浮动肘［6］，可解释杵状棘突为何不随腰椎屈伸发生同步位移；同时可见L5/S1椎间盘向右膨出并钙化，无神经根受压，右骶棘肌粗大（图2d，e）。

2 结果

2.1各组大鼠心功能指标比较 与空白对照组比较，模型组LVEF、LVFS降低，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV及血清CK、CK-MB、BNP均升高(P<0.05)；与模型组比较，中、高剂量参芍口服液组和阳性对照组LVEF、LVFS升高，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV及血清CK、CK-MB、BNP均降低(P<0.05)。见表1。

表1 6组大鼠心功能指标比较

2.2各组大鼠心肌组织病理学变化 空白对照组大鼠心肌细胞形态正常，胞膜、胞核清晰完整，肌丝无断裂。模型组大鼠心肌细胞可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，心肌细胞原有形态完全消失，大多数呈坏死、变性，可见少量肌纤维母细胞。中、高剂量参芍口服液组和阳性对照组大鼠心肌组织损伤有不同程度改善，可见新生小血管，肌纤维母细胞逐渐增多，联合呈网络结构，淋巴细胞及中性粒细胞减少，坏死细胞逐渐消失，胶原纤维增多形成瘢痕组织。见图1。

图1 6组大鼠心肌组织病理学变化A.空白对照组，B.模型组，C.低剂量组，D.中剂量组，E.高剂量组，F.阳性对照组；低、中、高剂量组分别予参芍口服液3.2、6.4、12.8 ml/kg

2.3各组大鼠炎性因子水平比较 与空白对照组比较，模型组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；与模型组比较，中、高剂量参芍口服液组和阳性对照组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 6组大鼠炎性因子水平比较

2.4各组大鼠心肌组织免疫组织化学染色及Western blot结果比较 免疫组织化学染色和Western blot结果显示，与空白对照组比较，模型组心肌组织Wnt10b、β-catenin表达显著升高(P<0.05)；与模型组大鼠比较，中、高剂量参芍口服液组和阳性对照组大鼠心肌组织Wnt10b、β-catenin表达显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织免疫组织化学染色及Western blot结果比较A、B.分别为免疫组织化学染色检测Wnt10b、β-catenin表达,C.Western blot检测Wnt10b、β-catenin蛋白表达;1.空白对照组，2.模型组，3.低剂量组，4.中剂量组，5.高剂量组，6.阳性对照组；低、中、高剂量组分别予参芍口服液3.2、6.4、12.8 ml/kg；与空白对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

3 讨论

参芍口服液根据中医辨证理论配伍，具有活血化瘀、调气养血等多重功效，对扩张外周血管、改善微循环具有一定效果，亦能抑制心肌纤维化，具有价格低廉、疗效显著、安全性高等优点。本课题组前期研究发现，参芍口服液具有抗动脉粥样硬化、调脂、抑制氧化应激和炎症反应等多种心肌保护机制[12-14]。血管生成是心肌再生的关键，瘢痕组织的形成与血管生成密切相关，构成心肌再生的天然屏障，促进血管生成，激活多种可降解胶原的细胞因子[15]。肌纤维母细胞在梗死区内规则排列，与心内外膜相连接，具有一定的收缩能力，能防止坏死的心肌膨胀和扩张，维持心功能。本研究发现给予参芍口服液干预后，镜下观察到大鼠心肌组织出现新生小血管及肌纤维母细胞，胶原纤维大量沉积，瘢痕组织形成，大鼠心室结构和心功能也显著改善，与HE等[16]研究结果类似，表明参芍口服液可促进AMI大鼠心肌组织再生，改善心室结构和心功能。

AMI后的炎症反应影响梗死范围和心室重构，被认为是改善AMI患者预后的潜在靶点[17]。AMI后的炎症反应可分为3个阶段，第一阶段是释放损伤相关分子模式蛋白，刺激天然免疫途径；第二阶段是在梗死区募集中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞；第三阶段是炎症反应消退[18]。AMI后过度持续的炎症反应可能会加剧心室重构。本研究发现，模型组大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，而给予参芍口服液干预后上述炎性因子水平降低，与WEI等[19]研究结果一致，表明参芍口服液可降低AMI大鼠外周血炎性因子水平，减轻炎症反应。

我们基于Wnt信号通路探究参芍口服液保护心肌的作用机制。Wnt信号通路参与心血管的胚胎细胞分裂、增殖、分化，在特定条件下能促进或抑制内皮细胞、心肌细胞的凋亡和死亡[20]。Wnt信号在健康成人器官中大多是沉默的，但在病理条件下通常观察到Wnt信号被重新激活。在沉默状态下，细胞质β-catenin水平较低，防止蛋白质进入细胞核激活基因转录，而在激活状态下，Wnt结合到卷曲蛋白，激活信号通路，使β-catenin在细胞质中积累，并能与相应的转录因子作用，参与肌纤维母细胞、血管内皮细胞等增殖、迁移至梗死区的过程[21]。本研究发现，AMI大鼠心肌组织Wnt10b、β-catenin表达上调，而经参芍口服液干预后，大鼠Wnt10b、β-catenin表达下调，与ZOU等[22]研究结果类似，表明参芍口服液可通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进心肌组织再生。

综上，参芍口服液可改善AMI大鼠心室重构和心功能，减轻炎症反应，促进心肌组织修复与再生，对心肌具有保护作用，这可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。