苹果腐败菌侵染过程的拉曼光谱成像表征规律

郭志明，郭 闯，王明明，宋 烨，陈全胜，邹小波

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东 济南 250220）

据联合国粮食及农业组织统计数据显示，中国苹果产量占世界苹果产量的45%以上，在我国水果经济中占有重要地位。但苹果采后贮藏过程中容易被腐败菌侵染导致变质，其中黑曲霉、青霉和链格孢是导致苹果腐败变质的最主要优势腐败菌。腐败菌侵染果蔬，是腐败菌与果蔬相互作用的过程，腐败菌会导致苹果组织细胞成分发生变化，这些变化反映了腐败菌的侵染过程。在感染早期，腐败菌主要潜伏在苹果果实的表面，随着贮藏时间的延长，果实由于生理衰老和环境条件的变化，抵抗力下降，潜伏的腐败菌就会通过伤口、气孔和花萼等部位进入果实并迅速萌发，渗透并产生菌丝体，不仅导致苹果腐败变质，而且其次级代谢产物真菌毒素具有致畸致癌的作用，严重危害人体健康，造成严重的食品安全问题。其中，某些腐败菌还会改变微环境，有利于腐败菌的生长，因此对果蔬产品中腐败菌的侵染过程及物理化学机理的研究非常有必要。

传统的腐败菌侵染过程的研究包括化学分析、电子显微镜、扫描电镜等，虽然可以准确地测定植物细胞的成分和结构，但是这些方法需要先破坏苹果组织细胞，测定步骤复杂，难以实时快速观测果蔬组织细胞成分的空间分布。新兴的检测技术，如免疫定位，需要进行复杂的分子修饰和抗原抗体连接，具有耗时长、价格昂贵的缺点。因此亟待开发一种有效的方法，实现腐败菌侵染苹果组织的原位监测和快速监测。

共聚焦显微拉曼光谱成像技术具有无损、免标记、快速、所需样品量少和样品前处理简单的优点，所构建的拉曼化学图像可以揭示组分独特的空间分布情况，并且继承了显微拉曼光谱成分检测的优势。利用拉曼光谱图像的指纹性可以揭示待测物的大分子成分分布信息，通过拉曼光谱中的细微变化还可以揭示多型体的分辨、有序度晶体与非晶体及材料的应变等分子结构信息，该技术已广泛用于生化分析和微生物检测。Rösch等采用共聚焦显微拉曼技术对培养皿上的5 种细菌菌落的类别进行判别。Li Yue’e等采用共聚焦显微拉曼光谱成像技术研究了镉对小鼠肝脏的损伤，为研究镉在人肝脏中的积累和毒性提供了参考。Pan Tingtao等利用共聚焦显微拉曼光谱技术检测腐败梨果的交链孢酚的含量。赵艳茹等利用共聚焦显微拉曼光谱成像技术对油菜茎秆横截面健康组织与染菌组织化合物进行化学成像，建立了核盘菌侵染茎秆的早期诊断模型。目前，共聚焦显微拉曼光谱成像技术多应用于生物医学研究，Li Guohao等利用磁性显微拉曼光谱平台以外泌体作为癌性标志物，对乳腺癌患者和健康人进行判别。Ma Danying等利用利用拉曼显微光谱学系统，对健康和乳腺癌组织进行原位拉曼光谱采集，揭示了乳腺组织癌变过程中许多生化成分的变化，有助于乳腺癌的早期监测和光谱诊断。在果蔬腐败方面的研究较少，利用拉曼化学成像技术阐释苹果优势腐败微生物的侵染过程具有重要的科学价值和实用意义。

本研究采用共聚焦显微拉曼光谱成像技术动态监测苹果优势腐败菌侵染过程中果实细胞和细胞间隙成分及结构的变化。以全新的视角阐述优势腐败菌侵染苹果腐败的机制：1）利用显微共聚焦拉曼光谱成像系统采集新鲜、侵染早期、侵染中期和侵染晚期苹果细胞壁及细胞间隙的拉曼光谱，通过与纤维素和果胶标准品的拉曼光谱比较，解析出苹果细胞成分的拉曼指纹图谱。2）比较不同侵染阶段的苹果平均拉曼光谱，分析优势腐败菌侵染过程中苹果细胞成分纤维素和果胶的变化情况。3）采用夹峰法，选取纤维素和果胶的拉曼特征峰构建伪彩色图像，分析在苹果细胞壁和细胞间隙的分布情况和腐败菌侵染过程中苹果组织细胞的细微变化。为采用拉曼化学成像技术研究腐败菌与果蔬组织互作的机制提供理论基础。4）对腐败菌侵染苹果不同阶段的拉曼光谱进行预处理和主成分分析（principal component analysis，PCA）、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）方法建立苹果不同腐败程度的判别模型，实现优势腐败菌侵染苹果组织的早期快速诊断。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验选用红富士苹果共计60 个，从江苏镇江水果批发市场挑选大小、形状一致，没有污染物和机械损伤的苹果。样品被运送到实验室，随后在4 ℃储存。实验前在室温（25 ℃）条件下放置24 h，使苹果温度与实验环境温度一致。

扩展青霉（CICC40658）、皮落青霉（CICC40656）、产黄青霉（CICC40654）、黑曲霉（CICC2089）和链格孢（CICC2527） 中国工业微生物菌种保藏管理中心；纤维素标准品、果胶标准品、乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；PDA培养基 国药沃凯有限公司。

1.2 仪器与设备

XploRA PLUS超快速拉曼成像光谱仪 堀场（中国）贸易有限公司；DSX-280B高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；Blue pard恒温恒湿培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；LED-3超净工作台 苏州净化设备有限公司；XB.K.25血球计数板 上海市求精生化试剂有限公司；一次性培养皿 镇江华东器化玻有限公司；一次性无菌手术刀 宿迁盛视医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 优势腐败菌的活化和培养

对优势腐败菌进行活化培养，转入第3代后，置于4 ℃冰箱中保存。选用PDA培养基，在85%相对湿度和28 ℃条件下进行培养。培养7 d后，用无菌塑料接种环收集腐败菌孢子并悬浮于无菌水中，用血细胞计数板将腐败菌悬液浓度控制在10CFU/mL。

1.3.2 苹果穿刺接种

选取新鲜的苹果，用75%乙醇溶液擦拭表面进行杀菌消毒，置于无菌操作台紫外线下照射30 min。采用无菌注射器针头沿苹果赤道部分进行穿刺，每隔120°穿刺一个孔，向孔中注入20 μL的菌悬液，将接种好的苹果置于恒温恒湿培养箱中进行培养，待腐败斑直径约为1 cm，取出染病果实切片，进行拉曼光谱图像采集。

1.3.3 组织切片制备

新鲜苹果切片：沿苹果赤道部位切取2 cmh1.5 cmh1.5 cm的苹果组织块，用手术刀切取0.5 cm厚的薄片，每个苹果组织块做3 个切片。共选取10 个新鲜苹果，共获取30 个苹果切片。

腐败苹果切片：选取不同菌种染病的苹果，每个接种点切取2 cmh1.5 cmh1.5 cm的苹果组织块。每种腐败菌选择10 个苹果，分别获取30 个苹果组织切片，共获得150 个苹果切片。每个苹果切片，按照距接种腐败中心点的距离划分为严重腐败（0.5 mm）、中度腐败（3.5 mm）、轻微腐败（7.5 mm）。用滤纸吸去切片表面多余水分，固定在载玻片上，进行拉曼光谱的采集。每个菌种选择2 个苹果组织切片用于拉曼光谱图像的采集。

图1 苹果组织样品制备流程（a）和腐败程度划分示意图（b）Fig.1 Preparation of apple tissue samples (a), and plot for spoilage degree division (b)

1.3.4 拉曼光谱与拉曼化学成像采集

1.3.4.1 苹果组织和标准品拉曼光谱采集

将苹果组织切片、纤维素和果胶标准品分别置于自动位移平台上，调节激光光斑聚焦到待测物表面，每个光斑点采集3 次，取平均值作为最后的光谱数据值。参数设置如下：激发波长为638 nm，光栅为600 grooves/mm，物镜倍数为50，衰减功率为50%，积分时间为10 s，累计次数为1，拉曼位移范围为300～3 020 cm，共聚焦孔径为100 μm。

1.3.4.2 拉曼化学成像

将切片固定到位移平台上，垂直方向固定不变，仅在水平方向进行成像，区域为苹果的细胞（180 μmh140 μm）及细胞间隙（50 μmh140 μm）。先在白光灯下采用50 倍物镜调整待测样品到清晰的视野，然后关闭白光，打开激光器，采用点扫描的方式采集待测样品的光谱，参数设置如下：激发波长为638 nm，激光功率衰减为100%，积分时间为1 s，采集步长为5 μm，每个点累计次数为1。扫描结束后，采用夹峰法，选取拉曼特征峰，构建伪彩色图像，以扩展青霉侵染为例，对腐败菌侵染过程中苹果细胞壁成分变化进行拉曼化学成像分析。

1.3.5 光谱数据处理及建模

为减少瑞利散射、噪声和荧光背景等对光谱数据分析的干扰，对采集到的拉曼光谱进行预处理和基线校正。然后采用PCA对预处理后的光谱数据进行降维处理和聚类分析，以简化数据、探索和识别样品数据中的潜在聚类。最后采用LDA对苹果4 种不同腐败程度的拉曼光谱数据进行判别分析。LDA是一种常用的模式识别方法，以最小化类内的方差，利用数据类之间的差异进行建模，广泛应用于检测分类和特征提取。本研究所涉及的光谱预处理采用LabSpec6软件，PCA和LDA数据处理均采用MatLab 2014a软件（Mathworks Co.USA）。

2 结果与分析

2.1 光谱预处理

由于原始拉曼光谱具有一定的光谱噪声和较高的荧光背景干扰，有效的光谱预处理非常重要。通过优选光谱预处理方法对光谱进行去尖峰、平滑和基线校正等处理，能够有效地减少光谱噪声，保留有用信息，有利于简化建模过程和提高模型的稳定性。因此在建模前，首先对光谱进行预处理。光谱预处理过程和结果如图2所示。图2a为原始拉曼光谱，图2b～d分别为去尖峰，平滑和去基线处理后的拉曼光谱。研究比较发现最佳的平滑去噪处理参数设置为：处理类型为降噪，拟合点数为126，拟合程度为2，因子为1。去基线参数设置为：背底拟合为多项式拟合，参数设定为拟合点数为2，拟合最大点数为236。通过光谱预处理，原始光谱的尖峰被去除，有效信息得到了保留，基线漂移现象得到了很好的改善。

图2 苹果细胞典型的拉曼光谱Fig.2 Typical Raman spectra of apple cells

2.2 苹果细胞成分拉曼光谱解析

苹果组织细胞壁由多种成分组成，因此采集到的拉曼光谱包含多个成分信息。研究根据采集到的苹果拉曼光谱峰，结合相关文献报道及标准品的拉曼光谱，对苹果细胞拉曼光谱进行解析。通过对苹果细胞壁的拉曼光谱峰进行物质归属解析发现，半纤维素的拉曼光谱峰位于526 cm和2 946 cm位移处，526 cm处为半纤维素的木聚糖分子振动，由于半纤维素和纤维素都具有相似的分子成分，因此2 946 cm也包含了半纤维素的CüH拉伸振动信息；果胶的拉曼光谱峰位于835 cm和875 cm位移处，其中835 cm为高甲基化果胶的-糖苷键振动，875 cm为低甲基化果胶的CüOüC异构体的骨架模式振动；木质素的拉曼光谱峰位于920 cm和1 467 cm位移处，920 cm为木质素的（CüOüC）平面对称振动峰，1 647 cm为木质素的üCHü弯曲振动峰；蛋白质的拉曼位移峰位于991 cm和1 645 cm位移处，其中991 cm为蛋白质的CüCH拉伸振动和丙氨酸振动，1 645 cm为蛋白质的酰胺I C=O拉伸振动。另外，423 cm和629 cm位移处的拉曼峰表示苹果细胞中的果糖成分。苹果细胞主要成分的拉曼光谱峰及其所对应的归属物质见表1。

表1 苹果细胞拉曼光谱峰的物质归属Table 1 Assignment of Raman spectral peaks of apple cells

2.3 腐败微生物侵染苹果不同阶段的平均拉曼光谱

苹果细胞壁主要包含纤维素、半纤维素、果胶和木质素等成分。腐败菌在侵染苹果组织的过程中，会分泌纤维素酶和果胶酶，水解苹果细胞壁，释放出细胞内的水和其他营养成分，进行生长和繁殖，随着腐败程度的增加，苹果细胞成分不断被腐败菌消耗，其拉曼光谱峰强度也会发生一定程度的变化。图3显示了苹果细胞在腐败菌侵染不同阶段（新鲜、轻微腐败、中度腐败和严重腐败）的平均拉曼光谱曲线。

图3 腐败菌侵染不同阶段的苹果细胞平均拉曼光谱Fig.3 Averaged Raman spectra of apple cells at different fungal infection stages

从图3可以看出，4 种腐败阶段的苹果细胞平均拉曼光谱具有一定的相似性，但是强度具有明显的差别，1 121、1 371 cm和2 946 cm处的拉曼光谱峰强度随着腐败程度的增加逐渐下降，表明腐败菌在侵染苹果过程中，产生纤维素酶，分解了苹果细胞纤维素，导致苹果细胞壁中纤维素含量的降低。这种趋势同样也发生在835 cm和875 cm处，表明腐败菌侵染导致苹果细胞果胶含量的降低。

2.4 腐败菌侵染过程中苹果细胞成分拉曼化学成像分析

为从微观角度观测黑曲霉侵染过程中苹果细胞成分的变化，采用拉曼化学成像技术对侵染早期、中期和晚期的苹果组织细胞进行成像分析。根据解析的多糖、纤维素、半纤维素和果胶的拉曼特征光谱，采用夹峰法，选取以上成分的特征光谱峰，以光谱强度构建这些成分在苹果组织细胞壁及细胞间隙中分布的伪彩色图像。伪彩色条颜色从蓝至红表示相应成份拉曼信号的强弱变化，颜色越靠近红色表明待测成分的含量越高。

2.4.1 糖类成分的可视化分布

由于2 946 cm处的拉曼光谱峰为糖类的CüH拉伸振动，为构建糖类成分在苹果组织细胞壁及细胞间隙中的分布图像，夹峰选取范围为2 900～3 000 cm位移处的光谱区间。由图4a可以看出，新鲜的苹果组织细胞形态呈圆形或椭圆形，大小均匀；中度腐败的苹果组织细胞，形状发生褶皱弯曲，细胞壁表面呈现高低不平的状态，原因可能是受到腐败菌的侵染，细胞壁成分被分解，细胞结构遭到破坏，细胞内含物流出，导致显微镜聚焦困难，视野模糊；而严重腐败的苹果组织，细胞发生坍塌，细胞表面凹凸不平，可能原因是细胞壁结构遭到严重破坏，整体细胞被分解。图4b、c显示了构建的糖类成分在苹果细胞壁中的糖类分布的伪彩色图和三维图，从多糖成分的伪彩色图像可以看出，糖类成分在细胞壁中呈不均匀分布的状态，越靠近角隅区和胞间层的区域含量越高，越靠近细胞间隙的部分，多糖含量越高；随着腐败程度的增加，多糖的含量呈下降趋势。

图4 苹果细胞壁中糖类成分分布图Fig.4 Distribution of carbohydrates in apple cell wall

2.4.2 纤维素成分的可视化分布

由于1 080 cm和1 121 cm处的拉曼光谱峰分别归属于纤维素的CüO和CüOüC糖苷键振动，为了构建纤维素成分在苹果细胞间隙中分布的伪彩色图像，通过夹峰法选取范围为1 050～1 150 cm处的光谱区间。构建的纤维素成分在苹果细胞间隙中的分布图像（图5）可以看出，新鲜的苹果细胞中，纤维素在细胞间隙中呈现不均匀连续分布的状态；中度腐败的苹果细胞中，纤维素含量明显下降，且分布较为离散，可能原因是腐败菌在侵染苹果的初期，产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，分解了纤维素；由于纤维素分布存在不均匀的情况，在严重腐败的苹果组织伪彩色图中，局部区域纤维素出现了较高的情况，甚至高于新鲜的苹果组织，而在其他区域，严重腐败的苹果细胞，相比于中度腐败，纤维素含量变化较小，可能是在腐败菌侵染末期，腐败菌的菌丝穿过细胞壁，进入了细胞内部，依靠细胞内部的营养成分大量繁殖。

图5 苹果细胞间隙中纤维素分布图Fig.5 Distribution of cellulose in the intercellular space of apples

2.4.3 果胶成分的可视化分布

由于果胶的特征拉曼光谱峰位于835 cm和875 cm位移处，因此通过夹峰法选取800～900 cm范围内的拉曼光谱构建果胶成分在苹果细胞间隙中分布的伪彩色图像。由图6可知，相比于纤维素成分，果胶在苹果组织中的含量较低，在新鲜苹果细胞中，果胶呈不均匀连续分布的状态，其中，中度和严重腐败的苹果组织，果胶分布状态较分散，原因是在腐败菌侵染过程中，分泌胞外果胶酶，水解细胞中的果胶成分。

图6 苹果细胞间隙中果胶成分分布图Fig.6 Distribution of pectin components in apple intercellular space

2.5 不同侵染阶段拉曼光谱聚类分析

由于预处理后的光谱数据具有较高的维度，存在冗余的光谱信息，给建模带来了复杂性，因此需要对预处理后的光谱数据在进行降维分析，减少无关信息对模型的干扰，提高模型的判别准确度。研究采用PCA对120 个拉曼光谱数据进行聚类分析，图7显示了4 个腐败程度的样本（新鲜、轻微腐败、中度腐败和严重腐败）在累计贡献率达97.58%的PC1、PC2和PC空间分布情况，从散点图可以看出，4 种腐败程度的拉曼光谱具有明显的聚类趋势，其中新鲜的苹果拉曼光谱与其他3 种腐败程度的苹果拉曼光谱存在较少的交叉，腐败程度越高，其与新鲜苹果组织拉曼光谱的距离越远，越容易被分开，而3 种腐败的苹果拉曼光谱之间均存在交叉现象。

图7 基于前3 个PC的不同侵染阶段苹果细胞样本的得分散点图Fig.7 Scatter plot of first three principal components for apple cell samples at different infection stages

2.6 不同侵染阶段判别模型的建立

为有效识别不同侵染阶段的苹果腐败程度，在PCA的基础上，采用LDA算法建立判别模型。首先分别获取了5 种苹果优势腐败菌在4 种不同侵染阶段的120 个拉曼光谱数据，在建立LDA判别模型的过程中，120 个样本数据被分为校正集（80）和预测集（40）。之后选取累计贡献率超过95%的前15 个PC作为输入变量，并对PC的数量进行优化。图8显示了LDA判别模型的PC数优化过程，可以看出，当选择前2 个PC时，模型的判别精确度较差，随着输入PC数的增加，模型的性能得到了极大的提高，当PC数超过10以后，模型的判别效果不再发生明显变化。表2统计了苹果5 种优势腐败菌的最佳判别结果，对于苹果优势腐败菌黑曲霉、产黄青霉、皮落青霉、扩展青霉和链格孢，当分别选取10、6、12、15 个和10 个PC时，判别效果最佳，预测集判别率分别为97.92%、100%、95.87%、100%、97.92%，这表明采用LDA模式识别方法分析苹果细胞成分变化的拉曼光谱数据，可以有效的对腐败菌侵染苹果进行早期诊断。

图8 苹果5 种优势腐败菌建立LDA模型的PC数优化黑曲霉（a）、产黄青霉（b）、皮落青霉（c）、扩展青霉（d）、链格孢（e）Fig.8 Optimization of number of principal components in LDA model for five dominant apple spoilage fungi Aspergillus niger (a), Penicillium chrysogenum (b), P.epidermidis (c), P.expansum (d) and Alternaria (e)

表2 苹果5 种优势腐败菌不同侵染阶段的LDA判别模型的统计结果Table 2 Statistical results of LDA discriminant model for different infection stages of five dominant spoilage fungi in apples

3 结 论

采用共聚焦显微拉曼光谱成像系统获取5 种优势腐败菌侵染苹果不同阶段的组织拉曼光谱图像，进行图谱解析和物质归属，发现苹果组织细胞中的纤维素、果胶、木质素和蛋白质等成分是拉曼光谱响应的物质基础。在不同侵染阶段，这些成分的特征拉曼光谱峰平均强度发生了明显的变化，随着腐败菌侵染程度的加剧，其强度逐渐下降。

针对腐败菌侵染过程中苹果细胞成分进行拉曼化学成像分析，通过拉曼化学成像成功的构建了多糖、纤维素和果胶成分在苹果细胞壁中分布的伪彩色图像。随着腐败菌侵染程度的加剧，多糖的含量呈下降趋势；中度腐败的纤维素相对于新鲜的苹果组织有所减少，但严重腐败的部分区域纤维素高于新鲜的苹果组织，可能是在腐败菌侵染末期，腐败菌的菌丝进入了细胞内部，依靠营养成分大量繁殖；相比于纤维素成分，中度和严重腐败的苹果组织中的果胶分布状态较分散，主要原因是在腐败菌侵染过程中分泌胞外果胶酶，水解细胞中的果胶成分。

采用PCA结合LDA算法建立了5 种腐败菌侵染苹果不同阶段的判别模型，判别准确率均达95%以上，其中产黄青霉和扩展青霉的判别率为100%，结果表明利用苹果组织成分变化的拉曼光谱进行腐败菌侵染程度的早期判别可行。

本研究以苹果为对象，采用共聚焦显微拉曼光谱成像技术对苹果优势腐败菌侵染苹果的过程进行了动态监测，建立了苹果腐败程度检测方法，并从微观角度对优势腐败菌侵染过程中苹果组织细胞成分及结构变化进行了可视化检测，研究结果表明，共聚焦显微拉曼光谱成像技术可实现腐败菌侵染苹果的早期诊断和过程解析。