夹心ELISA 检测新冠病毒及其抗原方法的建立和验证

周立娟，井申荣，苑荣亮，简建升，陈 伟**，邵聪文**

(1.昆明理工大学 医学院，云南 昆明 650500；2.浙江天元生物药业有限公司，浙江 杭州 311116)

新冠病毒SARS-CoV-2 是引起新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）（简称“新冠肺炎”）的重要病原体[1].新冠病毒属于β属冠状病毒，是一种具有囊膜结构的单链RNA 病毒，呈圆形或者椭圆形，直径60～140 nm[2-4].病毒主要通过呼吸道飞沫、密切接触、气溶胶等方式传播[5]，人群普遍易感.新冠病毒感染的临床表型有发烧、咳嗽、乏力等，重症患者会继发出现呼吸困难、多器官衰竭，最终可能导致其死亡[6-7].据世界卫生组织（WHO）实时统计数据显示，截至2021 年11 月30日，全球新冠肺炎确诊病例2.6 亿，累计死亡人数超过520 万.疫情波及五大洲的160 多个国家和地区，严重威胁着全人类的身体健康.目前，新冠病毒仍处于变异阶段，其突变位点数量多，传播性强，使得全球疫情进一步恶化，给世界经济带来危机.

新冠病毒主要由表面刺突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和核衣壳蛋白(nucleocapisid protein，N)等4 种结构蛋白组成[8].其中，S 蛋白被宿主细胞的弗林蛋白酶切割成S1 和S2 的亚基，S1 包含N-端结构域(N-terminal domain，NTD) 和受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)[9].新冠病毒的S 蛋白RBD 包含192 个氨基酸残基，主要通过与宿主细胞受体ACE2 的肽酶域（peptidase domain，PD）结合发挥病毒感染作用[10].目前，大多数研究主要集中在 S 蛋白及其上的RBD 区域，通过竞争性结合作用以阻断RBD 与ACE2 的相互作用，达到中和病毒的目的[11-13].因此，把RBD 域作为研发新冠病毒中和抗体的主要靶点尤为重要.

现阶段，核酸检测作为确诊新冠肺炎的“金标准”，虽具有灵敏度和特异性较高的优点，但费用昂贵，取样困难，对检测设备或平台要求较高[14].试剂盒的检测大多数用于确定血液样本中抗体的存在，间接证明人体已感染新冠病毒[15-16].由于检测样本中存在类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体等干扰因素[17-19]，易造成试验的交叉反应[20].新冠病毒抗原的检测可直接证明样本中含有新冠病毒，诊断快速、准确、对设备和人员要求低.因此，开发针对新冠病毒抗原蛋白的检测试剂盒具有重要意义.

本研究利用一对单克隆抗体，对抗原RBD 进行含量检测.我们首先以RBD 单克隆抗体（953）为捕获抗体，同时以辣根过氧化物酶（HRP）偶联的RBD 单克隆抗体（951）作为检测抗体，从而建立了双抗夹心ELISA 检测试剂盒并进行初步应用，以期为新冠病毒及其抗原S 蛋白RBD 的诊断和鉴定提供快速、简便的免疫学检测方法.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及抗体 磷酸二氢钾（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）、氯化钾（分析纯）、碳酸钠（分析纯）、碳酸氢钠（分析纯）、硫酸（分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；TMB 单组份显色液购自索莱宝公司；HRP 偶联试剂盒购自Abcam.磁力加热搅拌器购为绍兴市苏珀仪器有限公司产品；精密电子天平为梅特勒-托利多公司产品；卧式恒温振荡器为上海一恒科学仪器产品；全波长酶标仪为赛默飞公司产品.

1.1.2 仪器及试剂 磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸购自国药集团化学试剂有限公司；TMB 单组份显色液购自索莱宝公司；磁力加热搅拌器；精密电子天平；卧式恒温振荡器；全波长酶标仪；HRP 偶联试剂盒购自Abcam.

1.2 方法

1.2.1 酶标抗体的制备 根据辣根过氧化物酶抗体偶联试剂盒操作说明，按照抗体与辣根过氧化物酶（HRP）1∶4 的质量比，取25 μg 未偶联前的RBD 单克隆抗体（951）（25 μL）加入修饰剂2.5 μL，将其混合均匀加入到100 μg HRP 干粉上，置于22 ℃下避光反应3 h，迅速加入淬灭剂2.5 μL，避光反应30 min.将偶联成功的酶标抗体置于2～8 ℃保存备用.

1.2.2 酶标抗体偶联效果测定 利用间接ELISA 方法对未偶联前的RBD 单克隆抗体（951）进行效价检测.包被RBD 抗原100 ng，未偶联的RBD 单克隆抗体（951）从1∶10 000 开始，按照1.5倍梯度稀释后作为一抗孵育，以1∶10 000 稀释后的羊抗鼠作为二抗，测定未偶联的RBD 单抗效价；利用直接ELISA 法检测偶联后的RBD 单抗（951）的效价，直接包被RBD 抗100 ng，偶联后的RBD单抗（951）从1∶10 000 开始按照1.5 倍梯度稀释后作为检测抗体加入到孔板中，测定偶联后的RBD 单抗（951）效价.将偶联前后的RBD 单抗（951）测得的效价做比值计算偶联效率.

1.2.3 双抗夹心ELISA[21]用pH=9.6 的碳酸盐缓冲液（CBS）包被捕获抗体，100 μL/孔，同时设立阴性对照和空白对照各3 个重复，2～8 ℃包被过夜（10 h）.包被完成后，每孔用250 μL PBST 洗涤3 次；以5%的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加250 μL，37 ℃孵育1 h，孵育完成后，每孔用250 μL PBST洗涤3 次.将待检抗原按比例稀释每孔加100 μL，37 ℃孵育1 h，孵育完成后，每孔用250 μL PBST洗涤3 次.将检测抗体稀释后每孔加100 μL，37 ℃孵育1 h，孵育完成后，每孔用250 μL PBST 洗涤3 次.加TMB 单组份显色液100 μL/孔，37 ℃避光反应10 min，每孔加入50 μL 2 mol/L 硫酸终止反应，酶标仪读取OD450nm值.

1.2.4 捕获抗体及酶标抗体效价检测 在1.2.2中已通过直接法测得酶标抗体效价，在检测捕获抗体效价的过程中，按照酶标抗体1∶10 000 稀释（此时酶标抗体过量）.利用双抗夹心ELISA 法测定捕获抗体效价，捕获抗体从1∶10 000 开始按照2 倍梯度稀释，RBD 抗原100 ng/孔.根据捕获抗体效价检测结果，将其进行过量包被，RBD 抗原每孔100 ng，酶标抗体从1∶10 000 开始按照2 倍梯度稀释，检测酶标抗体效价.

1.2.5 方阵滴定法优化抗体工作浓度 在确定捕获抗体及酶标抗体效价后，探究捕获抗体和酶标抗体的最佳工作质量浓度.分别把捕获抗体从1∶20 000开始按照2 倍梯度稀释，酶标抗体从1∶20 000 开始按照2 倍梯度稀释，两两组合进行双抗夹心ELISA 检测，每孔加入RBD 抗原100 ng.根据结果确定包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度[22-23].

1.2.6 双抗夹心ELISA 方法的验证[24]

(1) 线性范围 将RBD 抗原从333 ng/mL 开始，按1.5 倍梯度稀释进行双抗夹心ELISA 实验，检测RBD 抗原含量.以抗原质量浓度为横坐标，OD450nm值为纵坐标，绘制标准曲线.以阴性对照组的2.1倍为阳性临变值，即试剂盒的定量下限值.

(2) 准确度 回收率实验是评价试剂盒准确度的一个重要方法.分别选取高中低14.8、6.6 ng/mL和4.4 ng/mL 3 个质量浓度的RBD 抗原，根据标准曲线算出实测质量浓度，重复3 次，取平均值.计算实测质量浓度与预测质量浓度的比值，即可得回收率.

(3) 精密度 确定在同一试验内同一个样品在测量范围内的不同质量浓度时测定的精密度.配制14.8、6.6 ng/mL 和4.4 ng/mL 3 个质量浓度的RBD 抗原，每个质量浓度重复测定3 次，计算每一质量浓度测定结果的均值、SD 值以及变异系数CV值，以此来确定所构建的试剂盒精密度和重复性是否良好.

(4) 特异性试验 利用已知的RBD 蛋白、新冠灭活全病毒、狂犬灭活全病毒、流感灭活全病毒、Vero 细胞分泌蛋白及E.coli全菌蛋白作为抗原，同时设阴性对照，每份样品重复3 孔，然后应用本试验建立的夹心ELISA 检测方法进行测定，用于确定构建试剂盒的特异性.

2 结果

2.1 酶标抗体偶联效果测定为了检测抗体偶联效果，分别对未偶联和偶联后样品进行ELISA 试验.如表1 所示，未偶联RBD 单抗效价为1∶101 300，偶联后RBD 单抗效价1∶67 500.通过偶联前后的RBD 单抗测得的效价进行比值，得出偶联效率约为66.6%.

表1 偶联前后抗体效价测定Tab.1 Antibody titer determination before and after coupling

2.2 捕获抗体及酶标抗体效价检测在抗原以及酶标抗体均过量的情况下进行双抗夹心ELISA 试验，确定了捕获抗体及酶标抗体效价.结果见表2，酶标仪读取450 nm 下的吸光度，测得捕获抗体的稀释比例为1∶160 000.在抗原以及捕获抗体均过量的情况下进行双抗夹心ELISA 试验，酶标仪读取450 nm 下的吸光度，测得捕获抗体的稀释比例为1∶320 000.

表2 捕获抗体以及酶标抗体效价测定Tab.2 Capture antibody and enzyme-labeled antibody titer assay

2.3 捕获抗体和检测抗体工作质量浓度的选择利用方阵滴定法测定捕获抗体和酶标抗体工作质量浓度，结果见表3.在捕获抗体工作稀释倍数不变的情况下，增加酶标抗体的工作质量浓度，阳性OD450nm值显著增加，而实际阴性空白对照的OD450nm值增加很小；在酶标抗体工作稀释倍数不变的情况下，增加捕获抗体的工作浓度，阳性OD450nm值显著增加，而实际阴性空白对照的OD450nm值变化不大.因此，确定酶标抗体稀释倍数为1∶10 000 和捕获抗体稀释倍数为1∶20 000为最适反应条件组合.

表3 捕获抗体和酶标抗体工作浓度的选择Tab.3 Selection of working concentration of capture antibody and detection antibody

2.4 试剂盒的线性和检测下限将RBD 抗原按照不同梯度稀释，分别进行双抗夹心ELISA 检测，读取OD450nm以抗原质量浓度为横坐标，双抗夹心ELISA 法测得的OD450nm为纵坐标，绘制标准曲线.结果显示相关系数R2=0.999，表明抗原质量浓度与OD450nm具有良好的线性关系.阴性对照OD450nm为0.061 6±0.02，即检测下限为31 ng/mL.通过四参数拟合形成典型的“S”型曲线（图1），图形对称，符合稳健可靠的四参数拟合要求.

图1 试剂盒标准曲线Fig.1 Standard curve of the kit

2.5 双抗夹心ELISA 方法的评价

2.5.1 准确度 利用构建的试剂盒对高中低不同含量的抗原进行检测，结果显示，其回收率分别为92.44%、95.92%和101.24%，平均回收率为96.53%（表4），表明本试剂盒准确性良好.

表4 试剂盒回收率测定Tab.4 Determination of the recovery rate of the kit

2.5.2 精密度 利用所构建的双抗夹心试剂盒对于3 种不同浓度抗原重复测定3 次，计算每一浓度测定结果的均值、SD 值以及变异系数CV 值，结果见表5，表明所构建的试剂盒精密度与重复性良好.

表5 试剂盒精密度测定Tab.5 Precision determination of the kit

2.5.3 特异性试验 利用双抗夹心ELISA 检测方法对包括RBD 在内的6 种抗原进行测定.除RBD 蛋白以及新冠灭活全病毒组外，结果均为阴性，说明该双抗夹心ELISA 方法具有良好的特异性(表6).

表6 试剂盒特异性测定Tab.6 The specific determination of the kit

3 讨论

由单克隆抗体构建的试剂盒在检测抗原过程中具有较好的结果重现性[25].本试验利用RBD 单克隆抗体（951）和RBD 单克隆抗体（953）两种单克隆抗体识别和结合抗原RBD 的不同表位，不仅可以降低交叉反应几率，还显著提升了检测的特异性和灵敏性.在RBD 单克隆抗体（951）与辣根过氧化物酶HRP 进行标记时，前人曾利用戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法制备酶标抗体[26]，但结果显示酶标抗体的制备过程较长且效价过低.因此，本试验选择使用偶联试剂盒对单克隆抗体（951）进行酶标，酶标后利用直接法测得效价为67 500 倍.通过包被RBD 蛋白，以未偶联的单克隆抗体（951）为一抗，羊抗鼠为二抗，测得效价101 300 倍，计算偶联效率约为66.7%.尽管我们反复优化抗体蛋白与过氧化物酶的比例，但偶联效率仍没有显著提高，这可能是由于过氧化物酶上的羰基活化不完全，导致与抗体的伯胺交联程度较低.

本研究通过方阵滴定法确定了捕获抗体（953）和酶标检测抗体（951）最适稀释度分别为20 000倍和10 000 倍，与已有检测试剂盒相比，该试剂盒抗体稀释度高，灵敏性强[27].在最适反应条件下建立标准曲线，其相关系数为0.999，表明构建的试剂盒相关性良好.本试验中构建的ELISA 试剂盒，最低检测下限为29 ng/mL，虽然该下限高于PCR 检测，但仍可以满足现阶段需求[28].本试验对试剂盒进行了方法验证，其准确度的平均值为96.53%，说明试剂盒稳定性良好；变异系数＜2%，显著低于现有的同类别试剂盒变异系数[29]，说明重复性良好.在特异性试验中，我们选用了与新型冠状病毒同属的流感灭活病毒，检测结果为阴性，说明试剂盒在检测时不会出现同属性的假阳性结果，且选用新冠灭活全病毒作为抗原进行检测时，检测结果为阳性，进一步证明了该试剂盒具有较好的灵敏性[27].此外，相比于现阶段检测新冠活病毒需在生物安全防护三级实验室进行，ELISA 方法不仅可以在普通实验室操作，而且不需要对技术人员进行特殊培训，操作简单[30].其他研究也报道了利用ELISA 试剂盒检测病毒抗原蛋白含量的方法，但检测过程中需要利用酶标二抗进行检测，使得整个检测周期延长[31].在本研究中，我们利用抗体直接酶标后进行样品检测，显著缩短了试验所需周期.

综上所述，本研究构建的ELISA 试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简单，检测周期短的优点.该试剂盒可以实现对新冠病毒以及RBD 抗原快速准确的检测，但是有效期未进行验证，仍需进一步探索.