网状纤维染色在鉴别子宫颈高级别上皮内病变与其伴间质浸润诊断中的临床病理学意义

张丽红，王随境，阳 霞，廖华东，张新科，陈杰伟

子宫颈癌是全球常见的恶性肿瘤之一，2020年有60.4万新增病例和34.2万死亡病例，严重危害女性的生命健康[1]。高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)属于子宫颈癌前病变。子宫颈上皮内病变(cervical intraepithelial neoplasias, CIN)是子宫颈上皮细胞不典型增生或者异常分化形成的增生性病变，但尚未发生浸润[2]，分为轻度不典型增生(CIN1)、中度不典型增生(CIN2)和重度不典型增生(CIN3)及原位癌，其中CIN2和CIN3属于HSIL。HSIL如未经治疗，30%以上可进展为浸润癌[3]。病理医师仅通过HE染色切片评估HSIL是否伴有间质浸润较为困难，急需寻找合适的染色方法进行鉴别诊断。为提高HSIL是否伴有间质浸润诊断的准确性和可重复性，本实验拟通过网状纤维染色检测HSIL基膜的表达情况，判断肿瘤与基膜的关系，以明确是否存在间质浸润，从而提高判断HSIL是否伴有间质浸润的准确性和可重复性。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年4月～2019年6月中山大学附属肿瘤医院病理科存档的87例子宫颈锥切石蜡标本，患者年龄32～62岁，平均47岁，其中23例既往被诊断为子宫颈HSIL(CIN3)，64例为子宫颈HSIL(CIN3)可疑间质浸润，调取病理科存档的石蜡组织连续切片备用；本组所有病例的诊断均参考WHO(2014)子宫颈肿瘤组织学分类标准。

1.2 网状纤维染色采用珠海贝索生物公司提供的网状纤维染色试剂盒(批号C201201)，操作步骤严格按照网状纤维染色的SOP进行。具体步骤：(1)石蜡组织切片75 ℃烤片15 min，二甲苯、乙醇脱蜡至水；(2)0.5%高锰酸钾氧化5 min，稍水洗；(3)2%草酸漂白2 min，流水冲洗2 min，再用蒸馏水稍洗；(4)2%硫酸铁铵媒染5 min，蒸馏水稍洗；(5)新鲜配置的改良Gomori银氨液反应50 s，蒸馏水浸洗2次，每次30 s；(6)10%中性福尔马林还原1 min，流水冲洗10 min；(7)核固红复染细胞核10 min，稍水洗；(8)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3 统计学方法石蜡标本由两位病理科主治医师结合HE染色与网状纤维染色进行独立诊断，有争议的病例由第三位高级职称病理医师作出诊断。诊断结果根据一致性及准确性两方面进行评价，一致性采用Kappa系数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网状纤维在HSIL中的分布特点(1)部分病例HE染色镜下可观察到黏膜全层见鳞状上皮增生，异型细胞局限于上皮层内，细胞核增大深染，核分裂象可见；部分病例可见上皮巢边缘光滑，呈栅栏状排列，上皮间质边界清晰，邻近的间质无纤维组织反应性增生(图1)。经网状纤维染色后，可观察到瘤周网状纤维完整、连续，呈线型，未突破基膜，基膜下的网状纤维未被破坏(图2)，呈经典的HSIL表现。(2)部分病例HE染色见上皮巢边缘毛糙，上皮间质边界模糊不清，邻近的间质疑似有纤维组织增生性反应，可疑小灶间质浸润(图3、4)，依据HE染色明确诊断有一定的困难；经网状纤维染色后，其中有些病例可见瘤周网状纤维完整、连续，呈线型，未突破基膜，排除了间质浸润(图5)；另外一些可疑间质浸润灶的瘤周清晰可见环绕的网状纤维被中断，基膜下的网状纤维被拉直，基膜处出现厚薄不一、不连续、断裂、崩解甚至消失等不规则现象，呈现出间质浸润的特征(图6)。

图1 黏膜上皮巢边缘光滑，呈栅栏状排列，上皮间质边界清晰，邻近的间质无纤维组织增生性反应 图2 瘤周网状纤维完整、连续，呈线型，未突破基膜，基膜下的网状纤维未被破坏，网状纤维染色 图3 黏膜上皮巢边缘毛糙，上皮间质边界模糊不清，邻近的间质疑似有纤维组织增生性反应，可疑小灶间质浸润 图4 黏膜上皮巢边缘毛糙，上皮间质边界模糊不清，邻近的间质疑似有纤维组织增生性反应，可疑小灶间质浸润 图5 瘤周网状纤维完整、连续，且呈线型，肿瘤细胞未突破基膜，网状纤维染色 图6 瘤周环绕的网状纤维被中断，基膜处出现断裂、崩解甚至消失等不规则现象，网状纤维染色

2.2 网状纤维染色对判断子宫颈HSIL是否伴有间质浸润的准确性两位病理主治医师根据子宫颈病变活检组织的HE染色结果对87例子宫颈病变诊断进行分类，其中23例HSIL和64例HSIL可疑间质浸润，均与原诊断保持一致；结合网状纤维染色再次进行独立诊断评价，统计结果显示：23例HSIL中两位医师均能得以验证；而64例HSIL可疑间质浸润的病例中确定为HSIL的例数分别为30例(46.9%)和29例(45.3%)，找到间质浸润证据的例数分别为34例(53.1%)和35例(54.7%)，两位医师诊断结果一致性极高，HE染色结合网状纤维染色方法具有极好的可重复性(Kappa=0.969，P<0.001)。其中仅有1例存在争议，该病例由高级职称病理医师根据染色情况诊断存在间质浸润。因此，网状纤维染色在判断HSIL是否伴有间质浸润中具有重要的参考价值，提示HE染色形态怀疑HSIL可疑间质浸润的病例，借助网状纤维染色可以明确间质浸润的情况，有助于提高HSIL是否伴有间质浸润诊断的准确率，更好地指导临床治疗。

3 讨论

HSIL属于子宫颈癌前病变，主要治疗方法为子宫颈锥切术[4]，HSIL伴有间质浸润主要行广泛性子宫颈切除术，子宫颈HSIL是否伴有间质浸润的诊断对治疗有重要意义[5-7]。

目前子宫颈病变的筛查主要为三阶梯式，即：HPV和(或)TCT检查、阴道镜检查、阴道镜指导下子宫颈活检，其中子宫颈活检被认为是子宫颈病变诊断的金标准[8]。病理医师通过镜下观察活检组织HE染色切片中细胞的形态进行诊断，当异常增殖的细胞达到上皮的2/3及以上时可诊断为HSIL，而当肿瘤细胞突破基膜时则诊断为存在间质浸润。

基膜是上皮细胞的基底面与深部结缔组织之间共同形成的薄膜，可以将细胞与结缔组织隔离，在电镜下基膜可分为两部分：基板和网板，其中网板是由结缔组织的成纤维细胞分泌产生，主要由网状纤维和基质共同构成[9]。网状纤维为细胞外间质成分，是Ⅲ型胶原纤维与嗜银蛋白多糖共同结合的产物[10]。对于基膜的染色，有针对糖蛋白的PAS染色和网状纤维的银浸染法，但PAS染色特异性较差，存在糖原、黏液等干扰，而网状纤维银浸染法结果稳定、定位准确，易于判读。自1905年Maresch应用于网状纤维染色后，现已发展成为一种稳定性、特异性及敏感性均较好的染色方法，连网状纤维中的细纤维均可显示[11]，这对于鉴定子宫颈肿瘤细胞是否突破基膜具有重要意义，故本实验采用网状纤维染色法显示基膜。

本实验对87例既往诊断为HSIL及HSIL可疑间质浸润的病例进行HE和网状纤维染色，发现部分病例组织的瘤周网状纤维完整、连续，呈线型，未突破基膜，基膜下的网状纤维未被破坏，可诊断为HSIL；而在另一部分病例，网状纤维染色见上皮癌巢突破基膜形似小芽状，进一步浸润时，发展成为钉状、舌状和泪滴状，从黏膜上皮或者所累及腺体的基膜分离出，癌细胞突破基膜，往平滑肌浸润，纤维胶原化之处由于网状纤维缺乏，基膜下网状纤维被拉直，癌组织之间清晰可见环绕的网状纤维被冲断，基膜处可出现厚薄不一、不连续、断裂、崩解或者消失等不规则现象，可确定为存在间质浸润。因此，病理医师通过镜下观察肿瘤细胞的浸润情况及网状纤维的完整程度可准确判断HSIL是否伴有间质浸润。

综上所述，在病理诊断过程中，对于通过HE染色无法明确判断HSIL是否伴有间质浸润的病例可以加做网状纤维染色，明确基膜形态，有助于准确识别HSIL是否伴有间质浸润，提高诊断的准确率，有利于子宫颈病变临床管理策略的制定。