基于多维拉曼光谱的乳粉表征及判别分析

顾 颖，赵姝彤，熊蓝萍，季 娜，洪 浩，张正勇

（南京财经大学 管理科学与工程学院，江苏 南京 210023）

乳制品作为消费者日常食品购买的重要组成部分，尤其是满足婴幼儿营养需求的重要食品来源，其质量安全问题一直深受我国市场主管部门和大众的关注，然而近年来，国内外乳制品相关质量安全问题仍时见报道，为此，国家“十四五规划纲要”明确提出要加强和改进食品安全监管制度，完善食品安全法律法规和标准体系，深入实施食品安全战略，着力提高食品安全检测技术[1]。针对乳制品质量安全风险，目前管控和研究策略主要包括：① 建立健全国家乳制品相关产品标准、检测标准；② 研究开发各类先进检测方法。如李涛等[2]研究建立了一种基于超高效液相色谱-质谱的乳粉中16种喹诺酮类药物检测方法；Mendes等[3]运用拉曼光谱结合主成分分析、偏最小二乘回归法进行了生牛奶中乳清的检测；Li等[4]研究构建了一种基于表面增强拉曼光谱的侧向流免疫传感器，可实现牛乳中黏菌素的快速识别。

不过现有研究主要集中于乳制品具体指标成分的测定方面，在乳制品整体品质控制方面研究案例还相对较为匮乏，突出表现在目前“海淘”过程中伪品、次品时有出现，以次充好“假乳粉”事件等，而伪次品各项指标可能是符合国家最低限定标准，造成新的监管困境，因此，迫切需要发展乳制品的品质快速判别新方法。本文提出了乳制品特征谱图分析思路，以牛、羊乳粉为例，从传统拉曼光谱、二维相关拉曼光谱两个方面构建牛、羊乳粉特征谱图，并进一步结合相似度分析算法量化分析了牛、羊乳粉谱图间的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用牛、羊乳粉：南京苏果超市。

1.2 仪器与设备

Prott-ezRaman-D3型激光拉曼光谱仪：激光波长785 nm，激光最大功率约为450 mW，CCD检测器温度控制在-85 ℃，积分时间为50 s，扫描次数为1次，光谱采集范围为250～2 000 cm-1，光谱分辨率为1 cm-1，美国Enwave Optronics公司；96孔板：美国Corning Incorporated公司。

1.3 方法

1.3.1 谱图数据采集方法

取适量乳粉粉末样品置于96孔板的各自独立小孔内，使得小孔恰好处于充满状态。而后，使用激光拉曼光谱仪光纤探头对准样品直接进行照射测试，收集信号，即得到样品的拉曼光谱数据。调节激光功率，分别在约255、320、385、450 mW条件下获取实验样品的拉曼光谱数据，用以构建三维拉曼光谱图。

1.3.2 谱图数据分析方法

拉曼光谱数据经光谱仪自带软件进行基线校正（SLSR Reader software 8.3.9，美国Enwave Optronics公司）、小波降噪处理（Matlab软件，美国Math Works公司），而后，使用2D-Shige软件（Shigeaki Morita，日本Kwansei-Gakuin大学）进行动态拉曼光谱数据的二维相关分析，得到样品的二维相关拉曼光谱图。

针对羊、牛乳粉的拉曼光谱和二维相关拉曼光谱数据，分别从相似性相似度、差异性相似度两方面进行样品的相似度分析。相似性相似度是衡量各光谱内在化学成分配比的相似程度，研究选取了相关系数法、向量夹角余弦法；差异性相似度是衡量两谱图间的差异，研究选取了欧氏距离法。

运算平台：MATLAB R2018a（美国MathWorks公司）。

2 结果与分析

2.1 牛、羊乳粉的拉曼光谱分析

羊乳不含牛乳中某些可能导致过敏的异性蛋白，因其脂肪和蛋白质颗粒也相对较小更易于被人体消化吸收，乳蛋白、免疫球蛋白含量较高，脂肪碳链较短等特点，受到消费者的广泛认可[5]。由于羊乳的产量较牛乳少很多，且价格普遍高于牛乳，因此，有必要建立牛、羊乳制品的特征谱图，加强对牛、羊乳的品质管控。拉曼光谱是近年来得到飞速发展的一种散射光谱技术，具有谱图数据采集速度快，样品前处理耗时少甚至无需样品前处理等特点，并且可便携化，十分适用于现场快速检测[6]。实验以牛、羊乳粉为研究对象，采集了其在不同激光功率条件下的拉曼光谱信号，如图1、图2所示。首先，可以参考已有文献[7-12]对谱图中的光谱峰进行物质归属分析，如在1 750 cm-1附近出现的拉曼光谱峰主要可能是源于与脂肪有关的酯C＝O伸缩振动，牛乳的光谱最高峰出现在1 460 cm-1，其主要是与源自糖类、脂肪的CH2变形振动有关，而羊乳的光谱最高峰出现在1 090 cm-1附近，主要是与源自糖类有关的C—O伸缩振动、C—C伸缩振动以及C—O—H变形振动，在1 010 cm-1附近出现的拉曼光谱峰是一个较为特殊的峰，其主要是与样品所含的蛋白质中苯丙氨酸的苯环振动有关，此外，通过谱图分析还可发现，羊乳在1 025 cm-1处出现的光谱峰较牛乳更为尖锐，羊乳在882 cm-1和385 cm-1处出现光谱峰，而牛乳在这两处没有明显的光谱峰，更多的光谱峰归属见表1。由此看出，通过拉曼光谱表征可以显示出牛、羊乳粉丰富的物质组成信息，主要含有脂肪、糖类和蛋白质分子，有个别拉曼光谱峰仅羊乳显现，在拉曼光谱的峰型、峰位置、峰强度方面，牛、羊乳粉谱图表现出明显不同，反映出牛、羊乳物质组成有一定差异。其次，从图中还可以看出，不同激光功率条件下，牛、羊乳样品的拉曼光谱峰呈现出一定的变化规律，比如在255 mW时，仅有少量的谱峰出现，随着激光功率增大，大量的谱峰开始出现，且谱峰强度明显增强，表现出一定的动态变化特征。

表1 牛、羊乳粉主要的拉曼光谱峰可能归属

图1 不同激光功率下牛乳粉拉曼光谱图

图2 不同激光功率下羊乳粉拉曼光谱图

2.2 牛、羊乳粉的二维相关拉曼光谱分析

前述分析揭示出牛、羊乳粉拉曼光谱随着外界条件变化呈现出一定的动态变化特征，据此可进一步开展二维相关分析，该技术是由Noda等[13-15]提出的一种新型光谱数据处理方案，基本思路就是收集样品在外扰作用下动态谱图，而后运用相关分析方法，实现多张谱图的重构融合，构建样品在三维空间中的特征谱图。为减少光谱采集过程中随机噪声对后续三维谱图构建的影响，实验采用小波降噪的方法进行了光谱预处理，选择coif1小波基，有效消除了光谱噪声[16]。进一步对上述降噪后的4张光谱数据，以平均峰为参考峰，运用二维相关分析法进行了三维谱图构建，图3为牛乳粉的二维相关拉曼光谱同步图，其最大的自动峰为（1 666，1 666），其他自动峰有（1 455，1 455）、（1 326，1 326）、（1 100，1 100）、（856，856）等，交叉峰有（1 455，1 660）、（1 290，1 440）、（1 100，1 290）、（870，1 110）等，由于动态光谱信号是随着激光强度增强依次增大的，故在新构建的三维光谱图中相关光谱信号均为正相关，数值为正值。采用同样的处理方法，得到羊乳粉的二维相关拉曼光谱同步图，如图4所示，自动峰有（1 666，1 666）、（1 455，1 455）、（1 265，1 265）、（1 100，1 100）、（870，870）、（366，366）等，交叉峰有（1 455，1 666）、（1 300，1 445）、（1 100，1 300）、（1 100，1 460）、（876，1 090）、（870，1 455）等，可以看出，牛、羊乳粉在三维空间特征谱图上差异显著，羊乳粉的出峰数量明显较多。

图3 牛乳粉二维相关拉曼光谱同步图

图4 羊乳粉二维相关拉曼光谱同步图

2.3 羊、牛乳粉的拉曼光谱相似度分析

基于拉曼光谱、二维相关拉曼光谱可表征样品丰富的化学组成、光谱特征信息，并可进行直观的肉眼鉴别，但是尚难给出样品间定量化的判别分析，因此，实验进一步结合相似度算法，进行量化分析[17]。实验随机选取了3个牛乳粉样品数据和3个羊乳粉样品数据，分别计算这6个样品数据之间的相似度。以各样品在450 mW条件下测试获取得拉曼光谱并经小波降噪后数据为输入，相关系数法计算得到牛乳粉样品间相关系数值为0.996 5～0.998 2，羊乳粉样品间相关系数值为0.985 7～0.998 6，而牛、羊乳粉样品间相关系数值为0.947 0～0.972 2。向量夹角余弦系数计算得到牛乳粉样品间夹角余弦值为0.997 7～0.998 8，羊乳粉样品间夹角余弦值为0.990 8～0.999 1，牛、羊乳粉样品间夹角余弦值为0.965 8～0.981 7。欧氏距离计算得到牛乳粉样品间欧氏距离为4.286 0×103～8.813 0×103，羊乳粉样品间欧氏距离为1.028 9×104～1.434 1×104，羊、牛乳粉样品间欧氏距离为2.080 9×104～3.847 9×104，如表2所示。

表2 拉曼光谱欧氏距离计算结果 ×104

以样品二维相关拉曼光谱数据为输入，相关系数法计算得到牛乳粉样品间相关系数值为0.994 9～0.997 3，羊乳粉样品间相关系数值为0.978 2～0.997 9，而牛、羊乳粉样品间相关系数值为0.921 9～0.958 0。向量夹角余弦系数计算得到牛乳粉样品间夹角余弦值为0.995 5～0.997 6，羊乳粉样品间夹角余弦值为0.980 5～0.998 1，牛、羊乳粉样品间夹角余弦值为0.931 0 ～0.962 6。欧氏距离计算得到牛乳粉样品间欧氏距离为6.395 0×107～1.632 5×108，羊乳粉样品间欧氏距离为2.019 8×108～3.097 2×108，牛、羊乳粉样品间欧氏距离为4.679 0×108～8.510 3×108，如表3所示。

表3 二维相关拉曼光谱欧氏距离计算结果 ×108

定量化的分析结果揭示出：① 无论是相关系数、夹角余弦，还是欧氏距离，结果均显示出牛、羊乳粉同品种样品间具有较高的相似度，而牛、羊乳粉不同品种样品间则表现出较大的差异度。同时，较之相关系数、夹角余弦值，欧氏距离刻画牛、羊乳粉样品间的差异性更为明显。② 与直接使用拉曼光谱结合相似度运算相比，二维相关拉曼光谱在揭示牛、羊乳粉样品内相似样品之间的差异方面，可提供更高的谱图分辨率，因而相关系数、夹角余弦值表现出下降的趋势，欧氏距离值则表现出增大的趋势。

3 结 论

实验提出并构建了牛、羊乳粉的多维拉曼光谱特征谱图表征方案，系统论证并定量化评估了牛、羊乳粉同品种样品间相似、不同品种样品间差异情况。拉曼光谱呈现了样品丰富的特征组分信息，二维相关拉曼光谱则呈现了样品动态变化特征，进一步结合相关系数、夹角余弦和欧氏距离算法，定量化分析结果揭示出牛、羊乳粉间的差异性较大，且二维相关拉曼光谱图分辨率更高，可实现样品有效判别。该实验方案具备在牛、羊乳粉鉴别、质量控制等多个方面的潜在应用价值，并且这种多维特征谱图构建和多层次分析思路也可为其他食品的质量安全监管提供借鉴。