人胎盘ATP结合盒转运蛋白对格列本脲胎盘转运的影响

黄桦，王晶晶，李骞，张峻（昆明医科大学第一附属医院临床药学科，昆明 650032）

妊娠期用药安全性受到社会高度关注，过去临床上通常以美国食品和药品监督管理局（FDA）的“妊娠期用药安全分级”为主要依据对孕期用药安全及风险进行评估，因FDA 分级过于依赖动物研究，且存在更新慢、分级简单、争议大等问题，越来越多的专家和学者建议完善妊娠期用药安全性信息，FDA 也于2015年提出更新妊娠期用药评价规则。但是，种属差异和伦理原则的限制给妊娠期用药安全性信息的获取带来困难。胎盘作为母体与胎儿之间的营养物质交换场所，是维持胎儿生长发育的重要器官和保护屏障。基于人胎盘建立的体外循环灌注模型是目前唯一一种用于研究物质在完整人胎盘组织中转运的实验模型，是研究外来物质（如药物、毒物、环境污染物等）能否透过胎盘、对胎儿造成暴露的经典模型，应用该模型进行药物的体外胎盘透过性研究是评价妊娠期用药安全性的重要依据[1-3]。

妊娠期糖尿病是妊娠期常见的并发症之一。妊娠期糖尿病患者应及时进行营养与运动干预，当饮食治疗和运动不能有效控制血糖时，胰岛素是治疗的首选药物。但由于给药途径和治疗费用等原因，孕产妇常无法坚持胰岛素治疗。因此，口服降糖药在妊娠期糖尿病治疗中的合理使用备受关注。第二代口服磺酰脲类降糖药格列本脲因使用方便，且经济有效，已被美国妇产科医师学会纳入妊娠期糖尿病可选择的口服降糖药之一[4]。但目前格列本脲在国内妊娠期使用安全性数据有限，并未纳入我国妊娠期治疗糖尿病的注册适应证。为此，本课题组前期应用人胎盘体外循环灌注模型开展了格列本脲的体外胎盘透过性研究，结果表明，格列本脲在中国人群中的胎盘透过率极低[5]，其原因除了较高的血浆蛋白结合率（99.8%）和较短的终末消除半衰期（约10 h）外，更重要的还归因于胎盘合胞体滋养层中的ATP 结合盒（ABC）外排转运蛋白，包括P-糖蛋白（PGP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）以及多药耐药相关蛋白（MRPs）等，格列本脲已被证明是ABC 外排转运蛋白的底物[6-7]。PGP 可将药物外排至细胞外，降低细胞内浓度，是胎盘屏障的重要组成部分，但是研究未证明PGP 参与了格列本脲的转运[6，8]。MRPs 主要分布在胞内膜系统上，通过囊泡转运排出进入细胞或胞内产生的有害物质。一项基于人胎盘体外灌注模型的研究表明，吲哚美辛的加入并未影响格列本脲的胎盘转运[9]；但另有研究表明，MRPs 能够优先参与格列本脲的转运[7]。BCRP 广泛分布于胎盘合体滋养层中，研究表明，BCRP 是格列本脲的主要外排转运体[7-8，10-11]。Hemauer 等[12]研究结果则表明，格列本脲被PGP、BCRP 和MRPs 转运的比例分别为（9±5）%、（25±5）%以及（43±4）%。由此可见，国外研究结果对于ABC 家族中参与格列本脲经胎盘转运的主要外排蛋白结论不一，且胎盘是最具种属差异的器官，因此，在中国人群中开展相关研究尤为重要。

为进一步明确格列本脲经胎盘转运的主要外排蛋白，本研究应用人胎盘体外循环灌注模型，并结合特异性PGP 抑制剂维拉帕米、BCRP 抑制剂尼卡地平和MRPs 抑制剂吲哚美辛，进行ABC外排转运蛋白对格列本脲经胎盘转运影响的研究，为格列本脲在妊娠期的合理使用提供参考。

1 材料

自然分娩或剖宫产刚娩出的健康、完整、足月（孕37 ～41 周）的人胎盘222 例（昆明医科大学第一附属医院产科），研究方案经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准[伦理批件号：（2016）伦理L 第5-1 号]。

磁力加热搅拌器P-HPS75（美国Talboys 公司）；蠕动泵（含Masterflex L/S 07523-90 泵控制台和Masterflex L/S easy-load Ⅱ泵头，美国Cole-Parmer 公司）；透明加热循环浴槽Itherm-19M（德国Vivo 公司）；Simplicity 纯水仪（美国Millipore公司）；血气分析仪SH138-iSTAT（美国雅培公司）；全自动化学发光免疫分析仪UniCel DxI 800（美国贝克曼库尔特公司）。

格列本脲对照品（美国Alfa Aesar 公司，批号：10099682，纯度＞99%）；维拉帕米对照品（批号：100223-200102，纯度＞99.9%）、尼卡地平对照品（批号：100586-201102，纯度＞99.9%）、安替比林对照品（批号：100506-200301，纯度＞99.9%）（中国食品药品检定研究院）；吲哚美辛对照品（大连美仑公司，批号：J0426A，纯度＞99.7%）；Krebs-Ringer Bicarbonate 缓冲液（迈晨科技有限公司，批号：D2712140）；牛血清白蛋白（美国Biosharp 公司，批号：MR30354）；碳酸氢钠注射液（济南利民制药有限责任公司，批号：13120802，规格：0.5 g）；肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号：1312108，规格：12500 单位）；乙腈（Merck 公司，色谱纯）；甲醇（Merck 公司，色谱纯）；甲酸（Adamas 公司，色谱纯）；水为自制超纯水。

2 方法

胎盘娩出运回实验室后，按照参考文献方法[2，5]建立母体侧和胎儿侧的双向闭合循环，并分为4 组，每组循环灌注10 例。各组的试验药物及其在母体池中的浓度分别为：

格列本脲组：格列本脲（200 ng·mL－1）；PGP 抑制剂组：格列本脲（200 ng·mL－1）和维拉帕米（13.5 μg·mL－1）；BCRP 抑制剂组：格列本脲（200 ng·mL－1）和尼卡地平（40 μg·mL－1）；MRPs 抑制剂组：格列本脲（200 ng·mL－1）和吲哚美辛（280 μg·mL－1）。30 min 预灌注后，在母体池中加入适量安替比林（终质量浓度为100 μg·mL－1）；并按照分组在母体池中加入试验药物。

循环灌注3 h，于循环开始后0、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min 采集母体侧与子体侧的样本，按本实验室前期建立的UFLCMS/MS 法[13]测定胎盘灌流液中格列本脲浓度。每30 min 从母体池取样，使用全自动化学发光免疫分析仪UniCel DxI 800 测定人绒毛膜促性腺激素 （β-hCG）浓度；每30 min 分别从母体和子体灌流液取样，使用血气分析仪SH138-iSTAT 检测pH 值、pO2、葡萄糖和乳酸。

模型建立成功的评价指标为[2-3，5]：① 阳性标记物安替比林的透过率＞20%；②3 h 循环灌注的子体侧渗漏量≤12 mL；③ 母体侧pO2维持在187 ～262 mmHg（1 mmHg ＝0.133 kPa），子体侧pO2维持在75 ～112 mmHg；④ 母体池和子体池pH 值维持在7.2 ～7.45；⑤ 葡萄糖消耗量、乳酸生成量以及母体池β-hCG 无较大波动。

格列本脲胎盘透过率按如下公式计算：FTR ＝Cf×100/Cm，其中Cf为循环结束时子体侧药物浓度，Cm为母体侧初始药物浓度。为降低不同胎盘小叶之间大小、绒毛层厚度、血管壁厚度等差异造成的误差，同时计算其相对透过率，即格列本脲胎盘透过率与阳性标记物安替比林胎盘透过率的比值。

3 结果

本研究共建立222 例胎盘体外循环灌注模型，其中符合评价指标的成功建模40 例。3 h 循环灌注过程中子体侧平均渗漏量（6.20±4.35）mL（n＝40），乳酸生成量、葡萄糖消耗量及hCG分泌（见表1）保持稳定，pH 和pO2均符合模型建立成功的评价指标要求（见表2）。

表1 3 h 格列本脲胎盘透过性实验中葡萄糖消耗量、乳酸生成量及β-hCG 的平均变化量(n ＝36)Tab 1 Glucose consumption，lactate production and β-hCG secretion in 3 hours of glyburide (n ＝36)

表2 3 h 格列本脲胎盘透过性实验中pH、pO2 检测结果(n ＝36)Tab 2 pH and pO2 of glyburide in 3 hours (n ＝36)

3 h 循环结束时，阳性标记物安替比林的胎盘透过率为（28.09±6.81）%（n＝40）。格列本脲组、PGP 抑制剂维拉帕米组、BCRP 抑制剂尼卡地平组以及MRPs 抑制剂吲哚美辛组格列本脲的胎盘透过率分别为（0.78±0.66）%、（2.17±0.90）%、（1.45±0.70）%、（3.65±2.10）%（n＝10）。不同ABC 转运蛋白抑制剂均不同程度地增加了格列本脲的胎盘透过率，见表3。

表3 不同ABC 转运蛋白抑制剂对格列本脲胎盘透过率的影响(x±s，n ＝10)Tab 3 Effect of different ABC transporters inhibitors on glyburide transplacental transfer (x±s，n ＝10)

4 讨论

本研究成功建立40 例人胎盘体外循环灌注模型，研究结果表明，转运体PGP、BCRP 与MRPs均不同程度地参与了格列本脲的胎盘转运，与未加入特异性蛋白抑制剂相比，MRPs 对格列本脲平均胎盘透过率的影响最大，PGP 次之，BCRP的影响最弱；根据相对胎盘透过率结果，MRPs和PGP 均对其有不同程度的影响，其中MRPs 影响较大，BCRP 基本无影响。推测在PGP、BCRP与MRPs 中，MPRs 可能是参与中国人群格列本脲胎盘外排的主要转运体。

预测药物的胎儿暴露情况对妊娠期用药安全性评价至关重要，人胎盘体外循环灌注模型直接应用人类胎盘组织进行研究，能够更真实直接地反映胎盘功能（包括物质交换、代谢和分泌等功能）及药物在胎盘中的转运情况。但该模型通常纳入健康足月胎盘建模，尚存在一定局限性。例如，对于妊娠期糖尿病患者，高血糖环境可能影响其胎盘的生理结构和功能，一项针对广东地区妊娠期糖尿病胎盘的研究表明，在基础胰岛素分泌降低并伴有胰岛素分泌紊乱及胰岛素功能抵抗的情况下，胎盘的组织结构和功能可能会发生变化[14]。格列本脲在妊娠期糖尿病患者胎盘中的转运情况是否与正常健康胎盘一致，仍需后续进一步研究。

5 结论

本研究应用人胎盘体外循环灌注模型，为国内首次进行ABC 外排转运蛋白对格列本脲经胎盘转运影响的研究。结果表明，在PGP、BCRP 与MRPs 中，MPRs 可能是参与中国人群格列本脲胎盘外排的主要转运体。本研究对完善格列本脲妊娠期用药的安全性信息具有重要意义，同时为我国妊娠期糖尿病患者用药选择提供决策参考。