圈养与野生川金丝猴应激水平的比较研究

王 炎 王娟娟 杨 静 郭含星 罗伟强 王晓卫* 严兴荣2，*

(1.陕西省动物研究所，西安，710032；2.陕西省野生动物保育重点实验室，西安，710043；3.西北大学生命科学学院，西安，710127；4.空军军医大学西京医院实验动物中心，西安，710032)

金丝猴(Rhinopithecus)共有5个亚种，其中4个亚种分布在中国。川金丝猴(Rh.roxellana)分布在四川、陕西、甘肃和湖北，黔金丝猴(Rh.brelichi)分布在贵州，滇金丝猴(Rh.bieti)和怒江金丝猴(Rh.strykeri)主要分布在云南，另外一个亚种越南金丝猴(Rh.avunculus)分布在越南和缅甸境内[1]。川金丝猴属于灵长目(Primates)猴科(Cercopithecidae)犹猴亚科(Colobinae)仰鼻猴属，是亚洲特有种。由于人类活动范围的扩大，川金丝猴数量明显减少，目前已被世界自然保护联盟(IUCN)列入濒危物种红色名录濒危等级(EN)，在我国被列入国家一级重点保护野生动物名录[2-3]。为了保护这一濒危物种，我国在川金丝猴分布的主要区域划定了国家级自然保护区，如陕西周至国家级自然保护区、陕西佛坪国家级自然保护区、贵州梵净山国家级自然保护区和湖北神农架国家级自然保护区等。目前，我国对川金丝猴的保护主要是对其栖息地的保护，保证川金丝猴的基本活动范围，以便其顺利进行种群繁衍。然而一些受伤、落单的川金丝猴很难回到原来的猴群，在野外难以生存，因此采取圈养的方式，以保护重要的遗传资源[4]。为了扩充人工圈养繁殖群体，早期多采用野外捕捉的方式，但圈养过程会导致野外川金丝猴产生不同程度的应激，如妊娠后流产的比例增加[5]。应激是机体受到外界刺激后，出现的保护自身的一种非特异性机制。应激分急性和慢性应激，急性应激能引起动物神经系统的精神障碍，表现为神经兴奋或抑制，内分泌表现为肾上腺皮质激素分泌的变化，尤其是皮质醇的变化[6]。慢性应激表现为多器官的功能异常，为了适应外界刺激，保护动物机体，机体各器官、系统也在调整适应慢性应激，如免疫系统、内分泌系统和消化系统等[7]。有研究表明，低温慢性应激影响西门塔尔牛(Simmental cattle)的免疫和抗氧化功能[8]；慢性应激对大鼠的肠道和肝脏可产生损伤[9]。圈养川金丝猴生活的空间和环境受限制，且常与人类近距离接触，长期处于慢性应激状态，如何减少应激水平和评价应激程度，是未来川金丝猴保护的一项重要工作。本研究通过提取川金丝猴粪便中的肠道细胞RNA，评价应激和生殖激素的水平，探索肠道细胞RNA提取效率、皮质醇和生殖激素水平的关系，为川金丝猴的保护提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 粪便采集

在川金丝猴的繁殖期(1月)，分别在楼观台野生动物救助站(该救助站有2个川金丝猴种群，约150只，采样30只)和佛坪野生动物保护区(该保护区有5个川金丝猴种群，约500只，采样其中一个种群中的45只)(表1)对不同年龄阶段川金丝猴的新鲜粪便进行多次采集，将采集后的粪便样本置于50 mL无菌离心管内，标记后保存于盛有干冰的保温盒中，带至实验室后置于冰箱内，-80 ℃保存备用。

表1 繁殖期川金丝猴的采样信息

1.2 RNA提取及PCR扩增

参考细胞RNA提取方法[10]，称取0.2 g粪便，加液氮研磨后置于含有1 mL Trizol试剂的1.5 mL无菌eppendorf(EP)管中，漩涡震荡1 min，-80 ℃过夜，漩涡震荡30 s，加入200 μL氯仿，震荡30 s，静置10 min，10 000 r/min离心15 min，取上清液于无菌EP管中，分别用异丙醇和75%乙醇沉淀洗涤后溶于20 μL无菌水中，备用。PCR引物设计用Primer 5.0进行，设计模板源于以往的检测数据[11]，β-actin上游引物为5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游引物为5′-AGGTAGTCAGTCAGGTCCCG-3′。用PCR试剂盒对目的片段扩增，分别加入模板、引物、2×Mix和水，在总体积为50 μL的条件下，扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。用GAPDH佐证，GAPDH上游引物为5′-TCCCTTTCGTAGGAGGGACT-3′，下游引物为5′-CTACTATGCCACCCCAGGAA-3′，反应条件和扩增程序同β-actin。

1.3 类固醇激素的提取

粪便类固醇的提取参考唐婕等[12]的方法。称取0.5 g川金丝猴粪便，置于含有研磨球和5 mL 90%的甲醇离心管中，高速研磨5 min后，5 000 r/min离心10 min，取4 mL上清液于15 mL离心管中，待有沉淀析出后再用6 mL 90%的甲醇研磨5 min，取6 mL研磨液于相同的离心管中，60 ℃烘干，再取1 mL甲醇充分溶解，将甲醇溶液吸取置1.5 mL EP管中，60 ℃烘干，用100 μL甲醇再次溶解后放置于冰箱中-80 ℃保存备用。

1.4 孕酮、睾酮和皮质醇激素的检测

激素检测用孕酮、睾酮和皮质醇ELISA检测试剂盒(均购自北京北方生物技术研究所)。检测方法参考Ahuja-aguirre等[13]的研究。首先配制不同浓度的标准品，制作标准曲线；然后将样品按要求稀释成稀释样品，将不同浓度的标准品、待测稀释样品加入96孔板的各孔中(每个样本重复3次)；最后加入酶结合物和抗体各50 μL，震荡混匀，贴上不干胶封条。样品37 ℃孵育90 min，机器洗板，拍干孔中水分后，加入显色液A和B各50 μL，37 ℃避光显色15 min，每孔加入50 μL终止液，10 min内在设定好的酶标仪上用450 nm波长检测OD值，通过标准曲线读出检测浓度。

1.5 数据统计

所有试验一式3份，数据用SPSS 13.0分析。数据以“平均值±标准差”表示。通过配对t检验比较分析，P<0.05判定为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 圈养和野生川金丝猴粪便RNA提取效率

抽提川金丝猴的细胞RNA逆转录成cDNA，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，发现全部个体中仅有3只圈养川金丝猴的样本出现目的基因条带(175 bp)(图1)，说明部分圈养川金丝猴肠道内的新鲜细胞数量较多。

为确认野生川金丝猴是否因其他原因导致RNA提取失败，随机选取5只野生川金丝猴和显示目的条带的3只圈养川金丝猴进行再验证，确认了3只圈养川金丝猴样品能提取出目的条带，而野生个体没有提取出目的条带(图1C)。

图1 圈养和野生川金丝猴目的基因条带

2.2 圈养和野生川金丝猴皮质醇激素水平差异

试验结果表明，圈养川金丝猴粪便中的皮质醇质量分数为(12.68±5.18)pg/g，野生川金丝猴为(3.64±1.54)pg/g，两组之间差异极显著(P<0.01)，说明圈养川金丝猴粪便中的皮质醇质量分数显著高于野生川金丝猴。

2.3 圈养和野生雌性成年川金丝猴孕酮和皮质醇水平差异

试验结果表明，圈养雌性川金丝猴皮质醇质量分数为(14.05±3.94)pg/g，野生雌性成年川金丝猴为(4.47±1.27)pg/g，二者组间差异极显著(P<0.01)；圈养雌性川金丝猴孕酮含量为(52.77±22.28)pg/g，野生雌性成年川金丝猴为(6.03±2.42)pg/g，二者组间差异极显著(P<0.01)，说明圈养雌性成年川金丝猴皮质醇和孕酮质量分数显著高于野生雌性成年川金丝猴。

2.4 圈养和野生成年雄性川金丝猴睾酮和皮质醇水平差异

试验结果表明，圈养雄性成年川金丝猴皮质醇质量分数为(10.35±5.48)pg/g，野生雄性成年川金丝猴为(2.39±1.00)pg/g，二者组间差异显著(P<0.05)；圈养雄性成年川金丝猴睾酮质量分数为(6.00±3.40)pg/g，野生雄性成年川金丝猴为(2.88±1.11)pg/g，二者组间差异显著(P<0.05)，说明圈养雄性成年川金丝猴睾酮水平显著高于野生雄性成年川金丝猴。

3 讨论

皮质醇水平是评价动物应激状态的重要指标之一，应激能提高血清、唾液、粪便和毛发的皮质醇水平[14]。粪便是获取无损伤样本最好的方式之一，粪便中的皮质醇含量是评价动物应激水平的可靠指标之一，用粪便皮质醇代谢物评价反刍动物的应激水平是可靠的评价方法[15-16]。

本试验提取RNA的效率相对较低，究其原因可能是提取的样本数量相对较少。提取出RNA的样本均来自圈养川金丝猴，说明圈养川金丝猴肠道环境可能与野生川金丝猴不同，关于此方面的研究报道较少，还需进一步研究。圈养川金丝猴的皮质醇含量高于野生种，其原因可能是圈养川金丝猴在饲养和各种健康检查过程中常受到来自人类及各种机器的惊吓，导致其长期处于应激状态，而野生川金丝猴因多数时间处于警觉状态，能够更好地应对外界突然刺激。因此，川金丝猴的保护应以就地保护为主，圈养保护为辅，在进行保护时，应尽量减少人为接触，多进行安抚。

动物应激水平与皮质醇含量呈正相关，有研究表明妊娠期间皮质醇和孕酮含量呈现相同的趋势，但分娩后皮质醇含量保持原有水平，但孕酮含量显著下降[17]。本研究发现圈养川金丝猴的皮质醇和孕酮含量显著高于野生川金丝猴，这可能与雌性川金丝猴的发情状态有关，有研究表明，皮质醇升高，孕酮水平也升高[18]，皮质醇和孕酮含量呈正相关[19]。也有可能是12月的楼观台温度比佛坪高，导致动物发情时间提前，或是圈养动物皮质醇高，引起了其他激素的变化。通过对裸鼹鼠(Heterocephalusglaber)的研究发现，睾酮和皮质醇的水平呈正相关[20]，这与本研究结果相似。引起圈养雄性川金丝猴皮质醇含量升高的原因可能与空间限制和圈养地点人密度较大有关[21-22]。

圈养川金丝猴粪便中的皮质醇、睾酮和孕酮质量分数显著高于野生川金丝猴，说明圈养条件会对川金丝猴的生殖激素造成影响，生殖激素的变化是否对川金丝猴的繁殖造成影响还需进一步研究。