成年雄性海南长臂猿肠道微生物群落组成的宏基因组学分析

李依蒙 毕 玉 金 崑*

(1.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，北京，100091；2.北京自然博物馆，北京，100050；3.海南国家公园研究院，海口，570100；4.中国林业科学研究院自然保护地研究所，北京，100091；5.生物多样性保护国家林业和草原局重点实验室，北京，100091)

海南长臂猿(Nomascushainanus)是我国特有种，隶属于灵长目(Primates)，长臂猿科(Hylobatidae)，冠长臂猿属。自20世纪50年代以来，由于历史原因，受人类活动影响，海南长臂猿栖息地大规模丧失，导致种群数量一度迅速减少，目前仅在我国海南热带雨林国家公园分布，数量为5个家庭群共35只，被列为我国一级重点保护野生动物，IUCN红色名录极度濒危(CR)物种。自20世纪70年代以来，研究人员对海南长臂猿开展了一系列的研究工作，集中于栖息地及家域[1-2]、种群数量[3]、遗传多样性[4]、食性[5]和行为[6-8]等，未见有关海南长臂猿肠道微生态方面的研究。

肠道微生物是栖息于动物肠道中所有微生物的总称，与宿主的健康和疾病密切相关。研究表明，肠道微生物在宿主体内发挥着营养、代谢和免疫防御等重要功能[9-10]。同时，由于非人灵长类动物与人类的亲缘关系最近，研究非人灵长类动物的肠道微生物组成对于人类肠道微生物的深入研究也有参考价值。近年来，我国已开展一些非人灵长类动物肠道菌群的研究，如猕猴(Macacamulatta)[11]、滇金丝猴(Rhinopithecusbieti)[12]和黑叶猴(Trachypithecusfrancoisi)[13]等。

动物粪便中的微生物组成能够反映其肠道中微生物群落的整体情况[14]。对于海南长臂猿这种营树上生活、极少下地的动物来说，粪便是可获得的非损伤性样本[15]。因此，本研究在旱季对海南长臂猿跟踪并采集新鲜粪便样本，基于宏基因组测序的方法揭示海南长臂猿肠道微生物组成及其功能，旨在揭示海南长臂猿肠道微生物与其食性之间的适应性关系，以期对海南长臂猿的保护与管理提供科学依据。

1 研究区概况

海南热带雨林国家公园坐落于海南岛西南部山区(18°57′—19°11′ N，109°3′—109°17′ E)，海南省昌江县和白沙县内，是我国生物多样性最富集的区域之一，主要保护海南长臂猿及其栖息的热带雨林森林生态系统，总面积约为29 980 hm2，海拔590～1 560 m。该公园属于热带季风气候，干湿季特征分明，每年11月—翌年4月为旱季，5—10月为雨季，年平均降水量为1 657 mm，年平均气温21.3 ℃。公园内的海南长臂猿食源植物约166种，隶属于52科99属，喜食植物为肉实树(Sarcospermalaurinum)、金叶树(Chrysophyllumlanceolatumvar.stellatocarpon)和南蛇藤(Celastrusorbiculatus)等[5]。

2 研究方法

2.1 粪便样本采集

2021年1月中旬—2021年5月，采用非损伤采样法，在海南长臂猿活动的区域进行粪便采集。采样过程：(1)聘请4位经验丰富的霸王岭林业局海南长臂猿监测队队员协助粪便样本的采集，在清晨海南长臂猿鸣叫之前到达监听点，听到鸣叫后，根据鸣叫声找到海南长臂猿家族群后用望远镜跟踪观察，基于个体大小、晨鸣等行为对个体进行识别，发现海南长臂猿排便后立即前往采集。为了确保粪便新鲜，只采集现场观察到排便的个体。(2)佩戴一次性无菌手套采集粪便，用解剖刀切除沾有泥土的部分，将无污染的中心部分放入15 mL无菌离心管中密封做好标记。(3)尽快将样品冷冻保存，由移动冰箱带回实验室，-80 ℃保存，用于后续试验。最终根据采集到的样本情况选择4个家庭群内的5只成年雄性海南长臂猿的粪便进行分析，粪便样品信息见表1。

表1 海南长臂猿粪便样品信息

2.2 宏基因组测序

海南长臂猿粪便中的DNA提取使用DNeasy PowerSoil Pro Kit(QIAGEN，Hilden，Germany)，依照说明书操作。使用1%琼脂糖凝胶电泳验证提取基因组DNA的完整性，如果电泳条带单一、明亮且无明显的拖带现象，说明基因组DNA完整且无降解。基因组DNA的浓度、纯度使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies，Carlsbad，USA)来确定。基因组文库的构建和上机测序交付北京百迈克生物科技有限公司完成，利用Illumina NovaSeq(Illumina Inc.，San Diego，CA，United States)测序平台进行宏基因组测序。

2.3 生物信息学分析

使用Trimmomatic v0.36对测序后得到的原始数据质控、过滤，得到有效数据，然后使用MEGAHIT v1.0进行宏基因组组装，过滤短于300 bp的contig序列。采用MetaGeneMark v3.26进行基因预测，接着使用MMseqs2(v12-113e3)去除冗余，相似性阈值设置为95%，覆盖度阈值设置为90%。去除冗余后的片段用于构建基因目录，综合各样本的有效数据得到基因目录在各样本中的丰度，将基因目录与Nr数据库比对，得到每个基因的物种注释结果，然后与KEGG(二级水平)、eggNOG数据库比对得到相关基因的注释结果。

3 结果与分析

3.1 宏基因组测序数据统计

测序数据经过质控、过滤，5份成年雄性海南长臂猿粪便共得到25 883.84 Mb有效数据，对应87 131 440条reads。Q20和Q30分别达到97%和93%以上，表明本次测序数据有较高可靠性(表2)。

表2 成年雄性海南长臂猿粪便宏基因测序数据

3.2 海南长臂猿肠道细菌组成

成年雄性海南长臂猿肠道中优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes，(55.78±9.19)%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，(33.13±11.88)%)。此外，放线菌门(Actinobacteria，(3.24±1.46)%)、纤维杆菌门(Fibrobacteres，(2.38±1.07)%)和螺旋体门(Spirochaetes，(1.24±0.80)%)也是相对丰度较高的菌门(图1A)。优势菌属为普雷沃菌属(Prevotella，(23.09±9.68)%)和梭菌属(Clostridium，(4.12±1.22)%)，拟杆菌属(Bacteroides，(3.28±0.93)%)、真杆菌属(Eubacterium，(3.00±0.67)%)和丝状杆菌属(Fibrobacter，(2.37±1.06)%)相对丰度次之(图1B)。

图1 海南长臂猿肠道细菌在门(A)和属水平上(B)的相对丰度

3.3 海南长臂猿肠道真菌、古菌和病毒组成

海南长臂猿肠道内优势真菌门包括壶菌门(Chytridiomycota，(43.26±11.94)%)、毛霉门(Mucoromycota，(26.64±10.16)%)、子囊菌门(Ascomycota，(18.97±10.83)%)和担子菌门(Basidiomycota，(8.03±2.46)%)(图2A)。优势真菌属包括根孢囊霉属(Rhizophagus，(26.13±11.29)%)、新美鞭菌属(Neocallimastix，(11.24±3.14)%)和梨囊鞭菌属(Piromyces，(10.55±4.39)%)(图2B)。

图2 海南长臂猿肠道真菌在门(A)和属水平上(B)的相对丰度

海南长臂猿肠道内主要古菌门为广古菌门(Euryarchaeota，(84.90±4.07)%)和泉古菌门(Crenarchaeota，(1.60±1.87)%)(图3A)。在属水平上，优势古菌属为甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter，(13.99±1.50)%)，此外甲烷囊菌属(Methanoculleus，(8.32±1.99)%)、甲烷球形菌属(Methanosphaera，(8.07±2.65)%)和甲烷八叠球菌属(Methanosarcina，(8.01±1.91)%)也是相对丰度较高的古菌属(图3B)。

图3 海南长臂猿肠道古菌在门(A)和属水平上(B)的相对丰度

海南长臂猿肠道内主要病毒种类为肌尾噬菌体科(Myoviridae，(26.90±11.74)%)、长尾噬菌体科(Siphoviridae，(20.71±7.73)%)、微小噬菌体科(Microviridae，(18.28±14.34)%)和短尾噬菌体科(Podoviridae，(5.23±5.86)%)等(图4)。

图4 海南长臂猿肠道病毒在科水平上的相对丰度

3.4 海南长臂猿肠道微生物基因功能注释

基于Unigenes的注释结果，绘制KEGG和eggNOG数据库的注释基因数目统计图。去冗余后的预测基因共有579 530个，其中有212 754(36.71%)个基因能够比对上KEGG数据库，有357 966(61.77%)个基因能够比对上eggNOG数据库。在KEGG数据库中，主要注释到的基因功能为新陈代谢(metabolism)、遗传信息处理(genetic information processing)、环境信息处理(environmental information processing)和细胞过程(cellular processes)。从功能数据上看，注释到的大部分基因与新陈代谢相关，如碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)和核苷酸代谢(nucleotide metabolism)等(图5A)。基于eggNOG数据库，在已知的基因功能分类中，复制、重组和修复(replication，recombination and repair)类别丰度最高，其次是碳水化合物转运与新陈代谢(carbohydrate transport and metabolism)、细胞壁/膜/包膜生物合成(cell wall/membrane/envelope biogenesis)和氨基酸的转运和代谢(amino acid transport and metabolism)等(图5B)。

图5 基于KEGG(二级水平)(A)和eggNOG基因功能分类(B)对非冗余基因集的功能注释

4 讨论

肠道微生物与宿主的健康状况紧密相关，灵长类动物与人类的亲缘关系最为接近，研究灵长类动物的肠道菌群组成情况，不仅对深入研究人类肠道菌群有参考价值，对于保护生物学也有重要意义。本研究通过非损伤取样法，结合宏基因组测序技术，首次对成年雄性海南长臂猿的肠道菌群组成进行了测序分析。研究结果显示，海南长臂猿肠道中的优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门，这一结果与前人对其他非人灵长动物(如黑叶猴和金丝猴等)的肠道菌群研究结果[13，16]相似。本研究的采样时间是在旱季，海南长臂猿在旱季食物相对匮乏，能够取食果实的植物种类减少，且分布不集中，会增加对植物嫩叶和花取食的策略或增加食物的摄入，弥补移动寻食所造成的能量消耗[5]。海南长臂猿肠道中厚壁菌门的相对丰度略高于拟杆菌门，由于厚壁菌门中的大部分细菌能够将纤维素分解为可挥发性脂肪酸而被宿主利用，而拟杆菌门的主要功能则是降解非结构性碳水化合物和蛋白质[17-18]，因此该结果与海南长臂猿在旱季的食性相对应。肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的比例(F/B)会影响宿主获取能量和吸收营养的能力，厚壁菌门占比的增长与宿主体重增加有明显的关联[19]，这是因为厚壁菌门中的大部分细菌类群能够分解复杂的碳水化合物，使从食物中获取的能量增加[20]。海南长臂猿在旱季肠道中这种较高F/B比例的菌群结构有利于其在食物匮乏的情况下更高效地从食物中吸收营养成分。与其他个体相比，A1和A3这两只海南长臂猿所在家族群活动范围较小，分布区域内食物更为丰富，肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的比例较为接近，而其他个体需要较高丰度的厚壁菌门来增加能量的获得。在属水平上，优势菌属瘤胃球菌属、梭菌属和普雷沃氏菌属等均能够帮助海南长臂猿降解树叶中纤维素和半纤维素等结构性碳水化合物[17，21]，这表明肠道菌群在海南长臂猿的营养消化吸收方面发挥着重要作用，反映了在动物的进化过程中，肠道菌群组成与动物的食性紧密相关。

海南长臂猿肠道优势真菌为根孢囊霉属和新美鞭菌属。根孢囊霉属是一种植物共生菌，能够提高植物抗旱性和对微量元素的获取[22]，可能是伴随植物一起进入海南长臂猿的消化道。新美鞭菌属在宿主对纤维的消化中起到重要作用，这类真菌主要存在于高纤维饮食的动物消化道中，由这种真菌分泌的多糖降解酶能够将许多不易降解的植物聚合物水解，从而降解非木质化的植物细胞壁[23]。海南长臂猿肠道优势古菌属为甲烷短杆菌属、甲烷囊菌属、甲烷球形菌属和甲烷八叠球菌属，这些产甲烷古菌广泛存在于植食性动物的胃肠道中[24-25]，通过消耗氢气保证消化道正常发酵的进行，促进纤维素和半纤维素的进一步分解。海南长臂猿肠道中的病毒种类多为肌尾噬菌体、长尾噬菌体、微小噬菌体和短尾噬菌体这类对宿主无害的噬菌体，它们能够特异性侵染细菌。基因功能注释的结果表明，大部分基因与碳水化合物代谢和氨基酸代谢等功能相关，同样与海南长臂猿的食性相吻合。

本研究通过宏基因组技术对雄性成年海南长臂猿的肠道微生物进行了测序分析和功能注释，对于了解该极危物种的肠道微生态特征及其功能有重要意义。

致谢：感谢海南霸王岭林业局海南长臂猿监测队王进强、邹正冲、黄卢标、李文永和王超东等工作人员的大力支持和帮助。