基于形态学及分子生物学鉴定广西昭觉林蛙的分布

张廷瑞 白林壮 黄亮亮 蒋正杰 岑财贵 郜二虎 贝永建

(1.桂林理工大学环境科学与工程学院，桂林，541000；2.玉林师范学院生物与制药学院，玉林，537000；3.广西金钟山黑颈长尾雉国家级自然保护区管理中心，隆林，533400；4.国家林业和草原局调查规划设计院，北京，100714)

蛙科(Ranidae)林蛙属(Rana)物种主要分布于欧亚大陆和美洲大陆，中国目前记录分布有27种，其中广西有4种，即徂徕林蛙(Ranaculaiensis)、寒露林蛙(R.hanluica)、越南趾沟蛙(R.johnsi)和猫儿山林蛙(R.maoershanensis)[1]。昭觉林蛙(R.chaochiaoensis)隶属于蛙科林蛙属，主要分布于四川、云南和贵州[1-2]，关于昭觉林蛙在广西是否有分布曾经存在争议。2006年，陆宇燕等[3]在广西猫儿山采集到1种林蛙，经形态鉴定为昭觉林蛙，并以《广西两栖动物一新纪录——昭觉林蛙》发表在《四川动物》上。但在2007年，Lu等[4]因在猫儿山采集到的昭觉林蛙标本形态特征不同于其他林蛙属物种，又重新将其确定为新种——猫儿山林蛙，并于2010年通过16S rRNA构建系统发育树，分子生物学证据显示，确定Yang等在广西猫儿山采集到林蛙属标本为猫儿山林蛙，而不是昭觉林蛙[5]。费梁等[2]和莫运明等[6]认为目前已有的资料和证据不足以说明广西分布有昭觉林蛙。因此，对于昭觉林蛙在广西是否有分布还缺乏有力的证据。

2021年7月，调查人员在广西金钟山黑颈长尾雉国家级自然保护区(24°34′5.06″ N，104°54′18.15″ E；海拔1 359 m)进行全国第二次陆生野生动物资源调查时采集到林蛙属标本1号(发现时，该标本刚被车辆碾压致死)，编号Ylussy0040，经形态学鉴定比较，与昭觉林蛙相似；经分子生物学分析，确定该标本为昭觉林蛙，为昭觉林蛙在广西的分布提供了形态学及分子生物学证据。

1 材料与方法

1.1 材料

取标本的肝脏组织保存于95%乙醇溶液中，用于提取总DNA。Ylussy0040标本浸泡在10%的福尔马林溶液中，保存于玉林师范学院。

1.2 形态鉴定

参照《中国两栖动物及其分布彩色图鉴》[2]对标本进行形态鉴定。

1.3 分子鉴定

利用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取总DNA。利用常规PCR扩增12S rRNA(引物H56/L13和H1478/L1091)和16S rRNA(引物H10/L2A和H4551/L3975)部分基因片段，引物序列见表1，PCR扩增条件和步骤参照Lyu等[7]的研究。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将片段大小符合要求的产物交广州艾基生物技术有限公司双向测序，测序引物为PCR扩增产物。

表1 引物序列信息

从GenBank下载包含12S rRNA和16S rRNA的21个林蛙属和蛙科部分相近物种的基因序列(表2)，结合本次调查中的标本序列，进行分子系统发育分析，以无指盘臭蛙(Odorranagrahami)和黑斑侧褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)为外群。在MEGA 7[8]中利用Align by Clustl W对所下载序列比对，人工校对比对后的序列，结果基于Kimura双参数模型计算物种间的遗传距离。使用贝叶斯法(Bayesian inference of phylogeny，BI)和最大似然法(maximum likelihood method，ML)构建系统发育树。用PhyloSuit v1.2.2软件选择最适模型[9]，构建BI系统发育树和ML系统发育树(ML系统发育树进行5 000次Bootstrap重抽样分析)。

表2 构建林蛙属系统发育树的相关序列

2 结果与分析

2.1 形态描述

Ylussy0040标本吻端钝尖、突出于下唇，吻棱明显，颊部稍向外倾斜有一浅凹陷，瞳孔呈椭圆形，背侧褶较宽厚而平直，在颞部上方不弯曲，从眼后直达胯部；体侧棕红色，散布不规则的小黑点，四肢背面有粗细不一的黑色横纹；背侧褶色浅，其上的橘红色小点明显，背侧褶间有隐约可见的不规则斑纹(图1A)；皮肤较平滑，有分散的圆疣，体背为红棕色，并散有橘红色小点(图1B)；手、趾指细长，上、下唇缘有灰黑色斑点，腹面光滑，呈乳黄色或乳白色，近胯部及股腹面为橘红色(图1C)。经形态学比较，采集于广西隆林的林蛙标本Ylussy0040与昭觉林蛙在形态特征上相符合。

图1 标本Ylussy0040的形态特征

2.2 系统发育分析

标本Ylussy0040的12S rRNA和16S rRNA基因片段经过比对拼接后，得到的有效序列长度为1 761 bp(12S rRNA长度为731 bp，16S rRNA为1 030 bp)，基因序列上传到GenBank，登录号为OL583993(12S rRNA)和OL444874(16S rRNA)。

基于BI和ML构建的系统发育树显示出相似的拓扑结构。BI发育树显示，采自隆林的林蛙标本Ylussy0040与昭觉林蛙模式标本(四川昭觉)聚为一支，且具有较高的支持率(100.0%)(图2)；ML发育树显示，采自隆林的林蛙标本Ylussy0040与昭觉林蛙模式标本相聚后构成单系，且具有较高的支持率(99.0%)(图3)。基于Kimura双参数模型估算的遗传距离表明，标本Ylussy0040与昭觉林蛙模式标本之间的遗传距离为0.4%，除标本Ylussy0040外，其他物种之间的遗传距离为1.0%～21.8%，Ylussy0040与昭觉林蛙模式标本的遗传距离远小于林蛙属其他物种(表3)。

图2 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列构建的林蛙属部分物种贝叶斯系统发育树

图3 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列构建的林蛙属部分物种最大似然系统发育树

表3 基于12S rRNA基因和16S rRNA基因计算林蛙属部分物种的遗传距离

经形态学和分子生物学系统发育分析，结合BI发育树、ML发育树和遗传距离结果，确定采集于广西金钟山黑颈长尾雉国家级自然保护区的标本Ylussy0040为昭觉林蛙，明确了昭觉林蛙在广西的分布。

2.3 生境描述

广西金钟山黑颈长尾雉国家级自然保护区位于广西壮族自治区西部，云贵高原边缘，在气候带上处于南亚热带。标本Ylussy0040采集于海拔1 359 m的郁闭度较高的山地常绿阔叶林林缘(图4)，位于保护区的核心区，周围植被茂盛，多为常绿阔叶林，采集点附近分布的两栖类动物有饰纹姬蛙(Microhylafissipes)、泽陆蛙(Fejervaryamultistriata)和锯腿原指树蛙(Kurixalusodontotarsus)等。

图4 广西昭觉林蛙的发现地

3 讨论

广西地处云贵高原的东南边缘，跨中亚热带、南亚热带和北亚热带3个气候区，气候温暖湿润，降雨量丰沛，地形地貌复杂，植被种类多样，孕育了丰富多样的两栖动物，其中林蛙属物种分布广泛，由于大多数物种形态较为相似，导致在野外很难鉴定[2]。近年来，随着分子生物学的发展，形态比较结合分子系统学分析方法对物种进行鉴定已被广泛应用[10-15]。

昭觉林蛙的体色随生境不同而改变，生活于林地的体色呈深棕色或棕黑色，生活于水边的体色为浅棕色，生活于深草中的为黑褐色[16]。标本Ylussy0040与昭觉林蛙模式标本相比，在形态上一致，与广西的4种林蛙属物种(徂徕林蛙、寒露林蛙、越南趾沟蛙和猫儿山林蛙)相比，标本Ylussy0040体背为红棕色，并散有橘红色小点，区别于徂徕林蛙(体背多为红褐色或棕灰色而无深色斑)和猫儿山林蛙(体背面多为红褐色或褐色，具有黑褐色条形斑或点状斑)，标本Ylussy0040左右跟部重叠较多，区别于徂徕林蛙(左右跟部重叠)、寒露林蛙(左右跟部明显重叠)和猫儿山林蛙(左右跟部仅相遇)，标本Ylussy0040颊部有一浅凹陷，区别于越南趾沟蛙颊部凹陷。

昭觉林蛙主要分布于四川西南部、云南和贵州西部[2]，标本Ylussy0040的采集地在广西百色市隆林县的广西金钟山黑颈长尾雉国家级自然保护区内。隆林县位于云贵高原的边缘，与云南和贵州的昭觉林蛙分布点很近，从地理位置上看，昭觉林蛙在隆林县分布具有很大的可能性。另外，该标本的采集地为海拔1 359 m的郁闭度较高的山地常绿阔叶林林缘，周围植被茂盛，环境潮湿，与昭觉林蛙模式标本的生境非常相似。

不同地理分区的同一物种会产生一定的遗传分化，物种间遗传距离越小，亲缘关系就越近。本研究从GenBank下载包含12S rRNA和16S rRNA的林蛙属和蛙科部分相近物种的基因序列构建系统发育树，计算遗传距离，发现Ylussy0040与镇海林蛙(Ranazhenhaiensis)、大别山林蛙(R.dabieshanensis)、峨眉林蛙(R.omeimontis)、长肢林蛙(R.longicrus)、寒露林蛙和越南趾沟蛙的遗传距离分别为3.8%、3.8%、3.9%、4.4%、4.7%和7.4%，和昭觉林蛙模式标本的遗传距离仅为0.4%，远小于其他林蛙属物种的遗传距离，且在系统发育树上与昭觉林蛙形成单系。因此，结合分子生物学分析和形态学比较，鉴定标本Ylussy0040为昭觉林蛙，为昭觉林蛙在广西分布提供了新证据，也丰富了昭觉林蛙的分布信息。