NSUN2对肾嫌色细胞癌患者预后的影响及潜在机制探讨

连 佳 曹 娜 崔旭锋

山西医科大学，山西省太原市 030000

在全球范围内，肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)在男、女性最常见的癌症中排名分别为第六和第十[1]，在全球最常见癌症死亡原因中排名第十六[2]。KICH是RCC中第三种最常见的亚型，占RCC的5%～7%[3]，其在临床病理常规诊断中由于形态学差异大，容易与良性肿瘤混淆，导致诊断较为困难，进而影响治疗和预后。提高诊断率、改善预后对于降低KICH的疾病负担具有重要意义。

RCC的进展和预后与m5C甲基化修饰有关[4]。m5C是指RNA胞嘧啶上第5位的碳原子被甲基取代，是第二常见的RNA甲基化修饰。NSUN2蛋白是主要的m5C甲基转移酶之一。近些年来对于NSUN2的研究主要集中胚胎发育和肿瘤发生发展过程[5-6]，而基于其分子结构、理化性质与KICH发生发展之间的关系尚未见相关报道。本研究利用生物信息学的方法对NSUN2基因及蛋白进行了结构和功能相关分析，并通过探讨NSUN2在KICH中的表达及其与KICH预后的关系，进一步分析其相互作用蛋白和与肿瘤相关免疫分子，以期为后续深入研究NSUN2的功能并揭示KICH发生、发展和预后等问题提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 NSUN2的基因和蛋白序列获取 均来自于美国国立生物技术中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站中对应的数据库。

1.2 NSUN2的基本理化性质分析 利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)，Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)在线网站分析其理化性质和亲疏水性，通过SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)在线网站进行信号肽结构分析，利用TMHMM Server 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)网站进行跨膜区域分析。

1.3 NSUN2的亚细胞定位分析 通过PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html)网站预测完成NSUN2的亚细胞定位分析。

1.4 NSUN2的组织表达特异性 通过NCBI网站上的Nucleotide数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)分析完成，TIMER2.0数据库(http://timer.cistrome.org)包含33种TCGA的癌症标本，用于分析NSUN2 mRNA在不同肿瘤中的表达情况，主要考察NSUN2 mRNA在肾嫌色细胞癌中的表达。

1.5 NSUN2与肾嫌色细胞癌预后的关系 利用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)提取NSUN2在TCGA数据库里多种癌症样本中的表达数据，分析基因表达与每种癌症的预后关系，主要考察NSUN2 mRNA与肾嫌色细胞癌预后的关系。

1.6 NSUN2的相互作用蛋白预测 通过STRING数据库(https://www.string-db.org)预测与NSUN2有相互作用的蛋白，以此构建PPI网络，并进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。

1.7 NSUN2与肿瘤免疫浸润、肿瘤微环境、免疫检查点分子的关系 利用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)在线分析软件中泛癌分析相关模块完成。

2 结果

2.1 NSUN2基本理化性质分析结果 NSUN2在NCBI基因库中的Gene ID为54888，该基因位于人的第5号染色体5p15.31位点，共有19个外显子。NSUN2蛋白的分子式为C3830H6048N1066O1145S35，总原子数达到12 124，相对分子质量为86 471。该蛋白含有767个氨基酸残基，其中共含有74个亮氨酸，为9.65%，占比重最大，色氨酸为1.72%，占比重最小。NSUN2蛋白中带负电荷残基(天冬氨酸残基+谷氨酸残基)的总数为106，带正电荷残基(精氨酸残基+赖氨酸残基)的总数为99，理论等电点为6.33，呈弱酸性。用ProtParam软件对NSUN2的半衰期、稳定性、脂肪系数、亲疏水性等性质进行预测，结果显示由于NSUN2蛋白在N端的氨基酸为蛋氨酸，因此其在哺乳动物网织红细胞中半衰期可达30h；NSUN2的不稳定指数(Ⅱ)为52.11，判定该蛋白属于不稳定蛋白；此外该蛋白脂溶指数为77.04，亲水性总平均值为-0.57，说明该蛋白质为亲水性蛋白质。随后利用Protscale软件对NSUN2蛋白进行亲疏水性预测，结果显示最低点位于555号的甘氨酸残基，得分为-2.84，最高点位于424号的缬氨酸残基，得分为2.56。NSUN2蛋白的氨基酸残基多数位于零点以下的负性亲水区域，且相对值较大，因此蛋白亲水性蛋白，与上述ProtParam软件预测结果一致。利用SignalP 5.0 Server对NSUN2蛋白信号肽切割位点进行分析，结果显示该蛋白中存在信号肽的可能性为1.5×10-3，说明NSUN2不含信号肽结构，属于非分泌蛋白。通过TMHMM Server 2.0预测提示该蛋白不具有跨膜螺旋结构。

2.2 NSUN2组织表达特异性、亚细胞定位 NCBI中的Nucleotide数据库可以确定所有蛋白质编码基因的组织特异性。本研究对来自95个样本的27种不同组织的RNA-seq结果进行分析，结果显示NSUN2在淋巴结中的表达最为广泛，其用于估计基因表达量的RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)值为14.21±4.57，在胰腺中的表达最低。利用PSORT Ⅱ对NSUN2的亚细胞定位预测结果显示，60.90% NSUN2蛋白位于细胞核内，21.70%位于线粒体，17.40%位于细胞质中。

2.3 NSUN2在肾嫌色细胞癌中的相对表达水平 癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)是由美国国家癌症研究所和国家人类基因组研究所合作建立的癌症研究项目，目前共收录了33种癌症类型。本研究利用TIMER2.0数据库分析33种肿瘤类型中NSUN2 mRNA的表达情况，结果提示在肾嫌色细胞癌(KICH)中NSUN2 的表达显著高于正常肾组织 (P<0.05)，见图1。利用Sangerbox 3.0分析NSUN2表达与TCGA数据库中每种癌症的预后关系，结果显示KICH中NSUN2高表达预后差[P<0.05,HR=12.23(1.64, 91.08)]。见图2。综上可见NSUN2可能是KICH潜在的预后因素。

图1 TIMER2.0分析TCGA数据库中NSUN2在肾嫌色细胞癌组织和正常肾组织中的相对表达水平

图2 Sangerbox 3.0分析TCGA数据库中NSUN2表达与KICH预后的关系

2.4 NSUN2的蛋白相互作用关系预测结果 蛋白质的相互作用在机体的众多生物学进程中发挥着重要作用，为鉴定与NSUN2相互作用的可能蛋白，本研究利用STRING软件对NSUN2相关蛋白进行了蛋白质互作网络的构建，选择最高置信度0.90，互作蛋白数量不超过10个，做出PPI网络图。预测结果显示，符合条件的NSUN2互作蛋白分别为：核仁核酸蛋白1(Nucleophosmin 1，NPM1，分值：0.99)，甲基转移酶1(Methyltransferase 1，METTL1，分值：0.99)，极光酶B(Aurora kinase B，AURKB，分值：0.97)，tRNA甲基转移酶1(tRNA methyltransferase 1，TRMT1，分值：0.96)，核仁素(Nucleolin，NCL，分值：0.95)，FtsJ RNA 2’-o-甲基转移酶3(FtsJ RNA 2’-O-methyltransferase 3，FTSJ3，分值：0.95)，纤维蛋白(Fibrillarin，FBL，分值：0.94)，核糖体生物发生因子1(Pescadillo ribosomal biogenesis factor 1，PES1，分值：0.93)，天门冬氨酸甲基转移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1，TRDMT1，分值：0.93)，假尿苷合酶7(Pseudouridine synthase 7，PUS7，分值：0.93)。交互网络共包括11个节点，35条边，平均节点度为6.36，该PPI网络的聚类P值<0.01。同时利用STRING数据库进行NSUN2基因GO功能注释和KEGG通路分析，结果显示NSUN2主要涉及RNA的修饰和装配等一系列相关生物过程；细胞组分主要集中在细胞核内；参与的KEGG信号通路主要有RNA代谢，rRNA和tRNA修饰加工等(见表1)。上述结果可能有助于我们探索NSUN2在体内的相关作用机制和通路。

表1 NSUN2和相关基因的GO功能注释和KEGG通路分析

2.5 NSUN2与KICH中免疫浸润、肿瘤微环境、免疫检查点分子的关系 为进一步探讨NSUN2与免疫之间的潜在关系，利用Sangerbox 3.0在线分析软件从肿瘤免疫浸润、肿瘤微环境和免疫检查点三个方面对其进行分析。结果显示，在KICH中，NSUN2表达与M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和调节性T细胞的免疫浸润显著相关。在肿瘤微环境方面，NSUN2与StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore无相关性(P>0.05)。免疫检查点分子和NSUN2之间的共表达分析提示，在TCGA数据库的KICH中，NSUN2与CD276、VEGFA、TNFB1及TLR4等显著相关(均P<0.05)。

3 讨论

KICH在RCC中占比为5%～7%，相比RCC的其他类型，例如透明细胞样肾细胞癌(clear cell RCC,ccRCC)和乳头状肾细胞癌(papillary RCC),KICH的预后明显较好[7]，然而KICH容易转移至肝脏，对预后和患者生存质量不利。因此寻找有效的诊断和预后生物标志物，有助于实现KICH的早期诊断并改善预后。本文通过运用多种生物信息学工具对NSUN2基因及蛋白进行了结构、功能以及生物学功能的预测和分析，并通过对TCGA数据库进行挖掘揭示了NSUN2表达与KICH患者生存率之间的关联。研究结果表明，NSUN2蛋白为弱酸性蛋白，具有不稳定性和亲水性，不含信号肽结构，属于非分泌蛋白，主要分布在细胞核内。NSUN2蛋白在人体组织中发布较为广泛，主要作为RNA甲基转移酶行使RNA修饰功能，参与基因转录后调控。

TCGA数据库挖掘结果提示，与正常肾组织相比，NSUN2在KICH肿瘤中高表达，并且表达升高与预后相关，说明NSUN2可能作为KICH的潜在预后因素。现有研究表明NSUN2与膀胱尿路上皮癌、胃癌、头颈鳞状细胞癌等许多癌症的发生、增殖、转移和预后等有关[8-9]，也有研究分析提示在12个m5C有关的调控因子中，有11个与RCC的预后相关，其中包括NSUN2[10]。

蛋白互作网络分析有助于从系统角度探究疾病分子机制、发现新药的作用靶点等。为进一步了解NSUN2在KICH中的生物学功能和潜在信号通路，本研究构建蛋白质互作PPI网络，并进行KEGG分析。STRING互作蛋白分析结果表明NSUN2的互作蛋白包括NPM1、METTL1、AURKB、TRMT1、 NCL、FTSJ3、FBL、PES1、TRDMT1和PUS7等。

NPM1与核糖体生物发生和p53稳定调控有关，有研究表明DDX31可能通过与NPM1的相互作用，调控p53-HDM2通路和rRNA基因转录，在肾癌发生中发挥重要作用[11]。METTL1介导m7G甲基化影响mRNA的翻译和胚胎干细胞的自我更新和分化，同时还与肝癌、结肠癌等癌症有关。AURKB是细胞有丝分裂的关键调控因子，参与染色体凝集、胞质分裂等生理过程，同时AURKB也被证明在肿瘤发生、进展和化疗反应中发挥重要作用。此外有研究发现AURKB在RCC组织中表达升高，并与RCC患者组织中的ALKBH5表达呈正相关，ALKBH5可能通过m6A依赖的方式调控AURKB从而促进RCC中的细胞增殖[12]。TRMT1作为tRNA甲基转移酶可能与肾透明细胞癌的预后有关[13]。FTSJ3可以与NIP7产生相互作用并且参与rRNA的装配，并且可能对癌细胞的侵袭和迁移具有抑制作用。TRDMT1同样作为m5C的甲基转移酶抑制肿瘤的分化和迁移。由此可见，NSUN2可能与PPI网络的下游蛋白产生相互作用，通过参与mRNA的转录后修饰进而调控肿瘤的发生发展。

本研究进一步从肿瘤微环境、肿瘤免疫浸润和免疫检查点分子四个方面探讨了NSUN2与免疫之间的潜在关系。有研究表明，肿瘤免疫浸润与RCC临床预后密切相关[14]，并且发现有些癌症预后相关基因与免疫细胞途径和检查点分子显著相关[15]。本研究结果提示在肿瘤免疫浸润方面，NSUN2与M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和调节性T细胞的免疫浸润显著相关;NSUN2和免疫检查点分子的共表达分析表明，该基因与TCGA数据集中KICH中的CD276、VEGFA、TNFB1及TLR4等显著相关。上述结果无疑都表明NSUN2与KICH的免疫密切相关。

本研究的特色在于通过生物学在线软件预测了NSUN2基因和蛋白的理化性质，并进一步挖掘了TCGA数据库中NSUN2在KICH中的表达，此外还分析了NSUN2相关的蛋白质相互作用网络、肿瘤微环境、肿瘤免疫浸润、免疫检查点分子等。综上所述，NSUN2可能是KICH的一个潜在预后预测因子，并与免疫密切相关。本文不足之处：首先，从TCGA数据库中能够获得的临床信息有限，包括潜在慢性病、免疫治疗的使用、肾切除术后复发等重要数据不能体现，并且TCGA中正常肾组织样本的样本量相对较小，可能会影响预测结果的准确性。其次，生物信息学分析结果提示NSUN2在KICH组织中上调。但是该结果仍需要临床样本中验证，本研究中利用生物信息学的方法预测出的可能的机制后续仍有待进一步的细胞实验和动物实验进行验证。但本研究得出的结论仍可为进一步探讨NSUN2在肾嫌色细胞癌中的作用以及可能存在的机制提供理论依据。