乐儿康糖浆的质量控制

张毅，王仲，杨贵生

(1.武汉市第四医院、华中科技大学同济医学院附属普爱医院药学部，武汉 430034；2.武汉华夏理工学院生物与制药工程学院，武汉 430070)

乐儿康糖浆由太子参、桑枝、黄芪、党参、山药、麦冬、制何首乌、大枣等13味中药组成，用于食欲不振、面黄、身瘦等脾胃气虚、厌食及营养不良症的治疗[1]。临床研究表明，乐儿康制剂能明显改善小儿食欲差、多汗、夜惊、烦躁、睡眠不安、体质量增加缓慢等症状[2]；能够提高患儿免疫球蛋白水平，改善反复性呼吸道疾病患儿免疫功能，增强机体抗病能力，降低呼吸道感染发生率[3]。中药及其制剂是多成分的集合体，各种成分具有不同的化学性质和药理作用，相互协调、相互制约，最终达到临床的治疗效果，多指标成分控制模式近年来已广泛应用于中药及其制剂的质量控制中[4-5]。乐儿康糖浆现行质量标准[1]单一成分质量控制难以全面反映其整体质量，笔者暂未检索到对该制剂多成分质量控制的文献报道，为全面评价乐儿康糖浆的整体质量，在本实验采用高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法对乐儿康糖浆中太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量进行同时测定，同时采用SPSS 26.0 版软件对多组分含量测定结果进行聚类分析和主成分分析，有利于指导药品生产企业不断改进生产工艺过程控制，稳定原药材产地来源，最终达到产品质量稳定性和临床疗效的一致性。

1 仪器与试药

1.1仪器 Shimadzu LC-20AT型高效液相色谱仪，配备SPD-10AVP可变波长紫外检测器(日本Shimadzu公司)；BT-25S型电子天平(德国Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Agilent TC-C18色谱柱(美国Agilent公司)。

1.2试药 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号：111920-201907，含量：96.8%，中国食品药品检定研究院)；太子参环肽B对照品(批号：18031328，含量：99.9%)、桑皮苷A对照品(批号：17060822，含量：99.5%)购自上海同田生物技术股份有限公司；芒柄花苷对照品(批号：PRF8081121，含量：99.6%)、芒柄花素对照品(批号：PRF8091225，含量：99.9%)、桑辛素对照品(批号：14030714，含量：99.6%)均购自成都普瑞法科技开发有限公司；二氢桑色素对照品(批号：CFS201802，含量：98.0%)、桑辛素M对照品(批号：CFS201801，含量：98.0%)均购自武汉天植生物技术有限公司；乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，其他试剂为分析纯；乐儿康糖浆(规格：每瓶装100 mL；批号：20181202，20190101，20190201，20190301，20190501，20190901，20190902，编号：S1～S7，购自长春英平药业有限公司；批号：190203，190401，200102，编号：S8～S10，购自通药制药集团股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品贮备液及混合对照品溶液 精密称取太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0.172，0.438，0.374，0.152，0.528，0.342，0.994和0.236 mg·mL-1混合对照品贮备液；精密量取混合对照品贮备液2.5 mL，置50 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，制成浓度分别为8.6，21.9，18.7，7.6，26.4，17.1，49.7和11.8 μg·mL-1混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液及阴性样品溶液 精密量取乐儿康糖浆5.0 mL，置25 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，制得乐儿康糖浆供试品溶液；按《中华人民共和国药典》2015年版一部中乐儿康糖浆质量标准项下的处方工艺，分别制备缺太子参、缺桑枝、缺黄芪的阴性样品，再上述方法制成阴性样品溶液。

2.2色谱条件及专属性实验 Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温25 ℃；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～9.0 min，38.0%A；9.0～14.0 min，38.0%A～46.0%A；14.0～23.0 min，46.0%A～55.0%A；23.0～37.0 min，55.0%A～72.0%A；37.0～44.0 min，72.0%A～80.0%A；44.0～50.0 min，80.0%A～38.0%A)，流速0.8 mL·min-1；进样量10 μL；检测波长分别为203 nm[6-7](0～14.0 min检测太子参环肽B)、305 nm[8-9](14.0～23.0 min检测桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素)和254 nm[10-11](23.0～50.0 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素)。精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液及“2.1.2”项下各溶液依法进样检测，色谱图见图1。由此可知，在与混合对照品色谱图中8种成分色谱峰的相应保留时间处，供试品色谱图中太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素色谱峰峰形对称，分离度均>1.5，理论板数按各成分色谱峰计均≥4500；太子参阴性样品色谱图中未见太子参环肽B色谱峰，桑枝阴性样品色谱图中未见桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素和桑辛素色谱峰，黄芪阴性样品色谱图中未见毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素色谱峰，表明阴性样品对乐儿康糖浆中8种成分的同时测定无干扰，该方法专属性良好。

2.3线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项混合对照品贮备液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分别用甲醇稀释至20 mL，在“2.2”项色谱条件下依次进样检测太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面积，以质量浓度(C，μg·mL-1)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行回归，结果见表1。表明太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素在各自范围内线性关系良好。

表1 8种成分的线性关系

2.4精密度实验、重复性实验、稳定性实验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，连续进样6次，测得太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素峰面积RSD分别为1.21%，1.08%，1.10%，1.33%，0.85%，0.99%，0.62%和1.14%。

按“2.1.2”项下方法平行制备同一批次乐儿康糖浆样品6份供试品溶液，依法进样测定太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面积，计算得8种成分含量的RSD分别为1.74%，1.59%，1.63%，0.87%，1.32%，1.71%，1.06%和1.54%。

取临用新配的同一份乐儿康糖浆供试品溶液，于制备后0，2，4，6，12，18 h进样检测太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面积，结果乐儿康糖浆供试品溶液18 h内稳定，8种成分峰面积的RSD分别为1.20%，1.06%，1.14%，1.35%，0.89%，1.01%，0.59%和1.11%。

2.5加样回收率实验 取8种成分含量已知的同一批次乐儿康糖浆样品适量，精密量取2.5 mL，共9份，置25 mL量瓶，按照《中华人民共和国药典》2015年版四部要求分别精密加入根据8种成分含量另行配制的混合对照品溶液(太子参环肽B 0.118 mg·mL-1、桑皮苷A0.292 mg·mL-1、桑辛素M 0.206 mg·mL-1、二氢桑色素0.084 mg·mL-1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.346 mg·mL-1、芒柄花苷0.242 mg·mL-1、芒柄花素0.654 mg·mL-1和桑辛素0.172 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL各3份，使各成分对照品加入量约为样品含量的50%，100%和150%，再按“2.1.2”项方法制成加样供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样检测太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面积，计算8种成分的含量，结果8种成分的平均加样回收率分别为98.51%，99.38%，97.72%，96.96%，98.70%，97.91%，100.08%和99.03%，RSD分别为1.15%，0.92%，1.36%，1.25%，1.47%，1.12%，0.76%和0.83%。

2.6含量测定 取乐儿康糖浆样品10批，按“2.2.2”项方法制备样品溶液(每批制备样品溶液3份)，在上述色谱条件下进样检测，采用外标法计算太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的含量，检测结果见表2。

表2 乐儿康糖浆中8种成分含量测定结果

2.7基于化学计量学的乐儿康糖浆质量分析

2.7.1聚类分析 以10批乐儿康糖浆中太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量为变量，采用SPSS 26.0版软件组间联接系统聚类方法，以欧氏距离为测量区间进行聚类分析，考察不同厂家乐儿康糖浆的含量差异，聚类分析结果见图2。结果显示，当类间距离为15时，10批乐儿康糖浆样品聚为2类，S4、S6、S1、S7、S2、S5和S3聚为第Ⅰ类；S8、S10和S9聚为第Ⅱ类。

图2 10批乐儿康糖浆聚类分析图

2.7.2主成分分析 将10批乐儿康糖浆中太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量测定结果导入SPSS 26.0版软件，进行主成分分析，计算特征值和方差贡献率，得到特征值和方差贡献率(表3)、主成分分析碎石图(图3)。以特征值>1为标准，得到2个主成分的累积方差贡献率为88.113%，大于85%，表明主成分1～2是影响乐儿康糖浆质量评价的主要因子。

图3 主成分分析碎石图

表3 特征值和方差贡献率

3 讨论

3.1成分选择 黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素等黄酮类以及黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ等皂苷类为其主要活性成分；太子参为石竹科植物孩儿参的干燥块根，太子参环肽B、太子参环肽A等环肽类为其特征性处分；桑枝为桑科植物桑的干燥嫩枝，主要含有多酚类、生物碱类成分，其中桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、桑辛素等为其多酚类代表性成分。同时考虑到黄芪皂苷类化合物没有紫外吸收或只在200 nm处有微弱吸收，常规的样品处理方法难以确保检测结果的准确性，且黄芪皂苷种类较多，紫外检测器难以有效分离，本实验参考中药标志物确认原则，选取君药黄芪所含活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素，臣药太子参特征成分太子参环肽B，佐药桑枝的代表性成分桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素和桑辛素为定量测定目标成分，为全面评价乐儿康糖浆的整体质量提供支持。

3.2流动相选择 本实验考虑到甲醇存在末端吸收，首先选用乙腈-水[6-7，11]流动相体系进行梯度洗脱同时检测乐儿康糖浆中的太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素，结果发现基线漂移严重，检测用时较长，部分色谱峰对称度不佳。考虑加入酸溶液加以纠正和改善，进而对乙腈-0.1%醋酸溶液[8]、乙腈-0.1%磷酸溶液[9]和乙腈-0.1%甲酸溶液[10]3个系统进行了考察。结果显示以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相系统时，色谱图基线平移，供试品中8种待测成分峰形对称，与相邻色谱峰能够达到有效分离。故采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相按照正文“2.2”项下流动相比例对乐儿康糖浆中太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量进行同时测定。

笔者在本实验采用HPLC梯度洗脱法对乐儿康糖浆中太子参环肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量进行了同时测定，建立了乐儿康糖浆多指标成分质量控制方法，所建立的方法简便快捷，准确度高，专属性强，能够为全面评价乐儿康糖浆整体质量提供参考依据。从8种成分含量检测结果及化学计量学分析结果来看，同一厂家生产的乐儿康糖浆产品质量差异较小，不同厂家乐儿康糖浆产品质量存在一定差异，可能与乐儿康糖浆制剂生产过程控制参数以及原药材产地、采收季节等差异有关，需引起生产企业关注，同时也表明建立多成分质量控制模式对确保中成药复方制剂质量稳定性和临床疗效的一致性具有重要意义。