人乳寡糖对大鼠结直肠组织放射性肠损伤保护作用研究

艾 默，杨宏，曲冬颖，姚爱林

北部战区总医院 妇产科，辽宁 沈阳 110016

肠道是对电离辐射较敏感的器官。有研究表明，放射性肠损伤的发生、发展及转归的主要原因包括肠上皮细胞损伤、炎症反应及氧化应激反应过度激活等［1-2］。目前，临床上治疗放射性肠损伤的效果不佳，主要是对症治疗。人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是200 多种不易消化和非营养性碳水化合物的复杂混合物［3］。其可调节肠道菌群环境，促进有益菌群的生长，还可以作为抗粘附抗菌剂，阻碍病菌与人体肠道黏膜细胞的结合，调节免疫系统［4-7］。HMOs 可以作为粘膜表面病原体的诱饵受体，影响宿主的健康状况，同时亦可通过增强肠道屏障功能改善宿主防御机制［8］。本研究旨在探讨HMOs 预处理对大鼠结直肠组织放射性损伤的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 HMOs 购自惠诚生物公司（中国），二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）购自国药化学试剂有限公司，抗Ki-67 抗体购自BD 公司，切割的caspase-3 抗体购自Cell Signaling 公司，CD31 抗体购自Abcam，FHs74Int 细胞来源于美国型培养物库，CCK-8 试剂盒购自美国Biotool 公司，多功能微孔板读取器购自美国分子器件公司，显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 实验动物及样品采集 6 周龄雄性C57BL/6大鼠30 只，体质量20～25 g，购自上海SLAC 实验动物有限公司（中国），在无特定病原体条件下饲养。所有动物实验均获得北部战区总医院伦理委员会批准。将实验动物随机分为空白对照组10 只，放射（irradiation，IR）组10 只，IR+HMOs 组10 只。IR 组及IR+HMOs 组予12 Gy 的60Co γ 射线一次性全腹照射，HMOs 组照射前3 d 口饲HMOs（10 mg/kg）。IR 后1 周处死大鼠。收集十二指肠（小肠上部）、空肠（小肠中部）和回肠（小肠下部），用10% 福尔马林固定12 h，切取组织，脱水，石蜡包埋，切片。

1.3 苏木精伊红染色 组织切片在70℃烘箱中烘烤30 min，二甲苯脱蜡5 min，通过梯度浓度乙醇（100%、95%、90% 和85% 各1 min）再水化，并用血红素染色3 min。清洗切片，在100% 乙醇中浸泡1 min，伊红复染20 s，染色后用梯度浓度乙醇脱水（75%、80%、85%、90%、95% 和100%，各1 min），贴于载玻片上，用光学显微镜观察。

1.4 肠绒毛长度测量及肠隐窝数计数 用光镜（200 倍放大镜）对组织切片进行分析，每组至少测量20 条肠绒毛的长度。组织切片采用光镜（200 倍放大镜）分析，每组10 个肠道标本计数，得到平均隐窝数。

1.5 免疫组织化学染色 对各组大鼠小肠组织切片进行免疫组织化学染色，切片在室温下与10%BSA（含0.3%tritonx-100）孵育1 h。加入相应的一级抗体抗TNF-α（1∶1 000）、抗IL-6（1∶2 000），4℃孵育过夜，PBS 洗涤后，加入二抗，室温下无光孵育2 h。PBS 洗涤后，加入DAPI 染色液，并在光学显微镜下观察。

1.6 RNA 提取和定量实时PCR 分析 采用Trizol分离来自组织和细胞的总RNA。然后使用M-MLV逆转录酶（Promega，美国）将总RNA（2 μg）反转录为cDNA。使用SYBR Green qPCR 预混液（美国罗氏公司）评估基因表达。

1.7 蛋白免疫印迹法检测 回肠组织利用RIPA裂解缓冲液进行裂解。提取后用BCA 法测定蛋白质浓度。全部样品（50 g），用8%～12% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用PVDF 膜吸附蛋白。5% 脱脂牛奶封闭后，用一级抗体Zo-1（1∶800）、Occludin（1∶1 000）、Claudin-1（1∶1 000）孵育，4℃下过夜。次日洗涤后加入二抗，室温孵育1 h，再次洗涤后，利用化学发光成像仪显影。

1.8 生化测定 取回肠组织，用丙二醛、总超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽和过氧化氢酶测定试剂盒（南京建城生物工程研究所）进行丙二 醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和过氧化氢酶（catalase，CAT）的生化测定。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism 6 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验；计数资料以例（百分率）表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMOs 预处理可减轻放射性肠绒毛损伤和隐窝丢失X 线（10 Gy）照射可引起大鼠小肠绒毛顶端断裂、绒毛脱落和绒毛长度缩短（约60 μm，P<0.05）以及肠隐窝数目下降（P<0.05）。与仅接受放射治疗的大鼠比较，HMOs 预防治疗大鼠绒毛长度缩短程度降低，肠隐窝数目损伤较小，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 HMOs对放射性肠损伤的影响（a.各组大鼠小肠组织染色图像，HE×200；b.HMOs对放射引起的肠绒毛长度的影响；c.HMOs对放射引起的肠隐窝数的影响）

2.2 HMOs 预处理降低辐射诱导的肠组织中炎症因子表达 为进一步验证HMOs 预处理对放射性肠损伤的保护作用，利用免疫组织化学染色对组织中的炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）进行检测。辐射可明显引起大鼠肠组织中TNF-α、IL-6 水平的增加（P<0.05）。IR+HMOs 组大鼠肠组织中TNF-α、IL-6 水平明显低于IR 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 HMOs 预处理改善辐射诱导的肠细胞完整性相关分子的表达 放射性肠损伤中，肠上皮细胞的完整性亦常受到破坏。采用蛋白免疫印迹法检测肠细胞中细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1 以及细胞骨架蛋白Zo-1 水平，结果发现IR 组大鼠肠上皮细胞中上述3 种蛋白较空白对照组均明显减少（P<0.05），说明放射性肠损伤存在肠上皮细胞紧密连接受损，其细胞完整性受到损伤；IR+HMOs 组Occludin、Claudin-1 以及Zo-1 蛋白水平较IR 组均有较明显升高（P<0.05）。见图3。

图3 HMOs预处理改善辐射诱导的肠细胞受损［a.肠切片免疫荧光染色（400倍）；b.蛋白免疫印迹法检测Occludin、Claudin-1以及Zo-1的表达；c.各组大鼠小肠组织中Occludin表达水平；d.各组大鼠小肠组织中Zo-1表达水平；e.各组大鼠小肠组织中Claudin-1表达水平］。

2.4 HMOs 预处理降低辐射诱导的肠组织氧化应激反应 生物体内自由基作用于脂质，发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，这会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒性。内源性抗氧化防御系统，包括酶促抗氧化剂（如SOD）以及非酶抗氧化剂（如GSH），其可清除或减少多种氧化剂［9］。通过生化检测发现，IR 组与空白对照组相比较，MDA 水平明显增高（P<0.05），SOD 及GSH 水平明显下降（P<0.05），说明放射性肠损伤存在氧化应激反应过度激活；IR+HMOs 组与IR 组相比较，MDA 水平明显下降（P<0.05），SOD 及GSH 明显增高（P<0.05）。结果表明，HMOs 预处理可在一定程度上降低辐射诱导的肠组织氧化应激反应。见图4。

图4 HMOs预处理降低辐射诱导的肠组织氧化应激反应（a.各组大鼠小肠MDA水平；b.各组大鼠小肠GSH水平；c.各组大鼠小肠SOD水平）

3 讨论

目前，近40% 生殖系统、泌尿系统和结直肠肿瘤患者曾接受放射治疗，而消化道是腹腔放疗中较常见的损伤部位，其中，近50% 的盆腔放射治疗患者存在明显的消化道症状，严重影响患者的生活质量［10-12］。射线杀伤的成熟上皮细胞死亡损伤高峰大约会在其辐射后的第3 日出现［13-14］；且射线对分化、增殖能力强大的肠上皮干细胞更具杀伤力，能直接导致肠道屏障功能受损、肠道菌群失调、肠黏膜损伤、通透性增加等病变，严重者可出现细菌感染导致的全身炎症、脓毒血症、多器官功能障碍综合征等［15］。本研究结果显示，辐射可致大鼠肠绒毛损伤及隐窝明显减少、炎症因子表达明显增加、肠上皮细胞完整性明显下降以及肠免疫应激过度激活。HMOs 是存在于母乳中的一类重要低聚糖，其成分复杂且丰富，含有许多生物分子，如免疫球蛋白、先天性糖蛋白、生物活性肽、抗体、糖脂、游离脂肪酸、细胞因子和趋化因子等［16］。有研究表明，HMOs 的一个重要特性是免疫调节，通过直接调节肠细胞的基因表达，使细胞表面聚糖和其他细胞反应的表达发生变化，调节淋巴细胞因子的产生，使免疫反应更加平衡［17］；另有研究显示，HMOs 可通过调节肠道微生物菌群来预防坏死性小肠结肠炎、念珠菌病和一些免疫相关疾病的发生［18］。本研究中，用HMOs 预防治疗与仅接受放射治疗的大鼠相比较，绒毛长度缩短程度降低，肠隐窝数目损伤较小；IR+HMOs 组与IR 组相比较，肠组织中炎症因子TNF-α、IL-6 水平明显降低；HMOs 预处理可改善辐射诱导的肠细胞受损，明显降低辐射诱导的肠组织氧化应激反应。这说明，HMOs 预处理可在一定程度上降低辐射对肠道的损伤作用。

综上所述，HOMs 作为一种多聚糖，在放射性肠损伤疾病中能发挥抗炎、修复损伤以及免疫调节作用，在一定程度上对RE 具有保护作用。