Z-VAD-FMK抑制凋亡通路对体外培养玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的影响

卢美蓉，王 静，黄广翅，李桂花，刘秀盈，蔡杏琳 (.海南现代妇女儿童医院妇产科，海南 海口 57000；.海南现代妇女儿童医院检验科，海南 海口 57000；.海南医学院第一附属医院产科，海南 海口 5700)

卵母细胞超低温保存是保持生育能力的重要策略[1]。然而促性腺激素刺激卵母细胞成熟可能并不适合所有有保存生育能力需求的女性，如多囊卵巢综合征或激素依赖性癌症患者[2]，对这类患者可在没有激素刺激的情况下从卵巢中采集未成熟的卵母细胞[3]。但玻璃化冷冻未成熟卵母细胞(vitrified immature oocytes，VIOs)经过多次冷冻后，会影响其减数分裂和复苏后正常发育能力的恢复，同时超低温保存可能会诱导细胞凋亡[4-5]。有研究发现，添加抗冻蛋白或抑制信号转导调控因子可有效提高VIOs的发育能力，并且在猪VIOs中被证明是适用、有效的方法[5-6]。半胱氨酸蛋白酶Caspase是细胞凋亡过程中参与蛋白水解和DNA断裂的效应酶，Z-VAD-FMK是一种广谱细胞渗透性Caspase抑制剂，已成功用于逆转猪和牛胚胎及不同体细胞经冷冻诱导的凋亡变性[6-7]。本研究旨在探讨Z-VAD-FMK抑制凋亡通路对体外培养小鼠未成熟VIOs的DNA完整性和发育潜能的影响，以期为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

200只雌性SPF级ICR小鼠，5～6周龄，购自上海亓上生物医学科技有限公司[生产许可证号：SCXK(沪)2021-0004]。将小鼠置于22～28 ℃、光照/避光交替12 h环境下饲养，保证食物和水充足。本研究经海南医学院第一附属医院实验动物伦理委员会批准(LHK2019012)。除另有说明，本研究所有化学品和试剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 未成熟卵母细胞的获取

200只雌性ICR小鼠腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素超排，48 h后颈椎脱位处死。取卵巢，置于1 mL改良小鼠输卵管液中，加入20%(V/V)牛血清白蛋白，穿刺有腔卵泡，收集覆盖有致密卵丘细胞的未成熟卵丘—卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。

1.3 未成熟COCs的玻璃化冷冻和复苏[8]

玻璃化冷冻：将未成熟COCs悬浮于含有7.5%(V/V)乙二醇、7.5%DMSO的平衡溶液中培养 5 min，然后移至含15%(V/V)乙二醇、15%(V/V)丙三醇、0.5 mmol/L蔗糖溶液和20%(V/V)FBS的TCM-199培养基中，置于冷冻薄膜聚丙烯带45～60 s。将 5～6个卵母细胞装入CryoTop，并立即投入液氮中贮存。复苏：冷冻薄膜在37 ℃含有1 mmol/L蔗糖解冻溶液及20%(V/V)FBS的TCM-199培养基中浸泡 1 min，提取玻璃化冷冻的卵母细胞，并移至含有 0.5 mmol/L蔗糖溶液和20%(V/V)FBS的TCM-199培养基中培养 3 min，然后在不含蔗糖的TCM-199培养基中培养5 min。

1.4 COCs分组

实验Ⅰ用于探讨玻璃化冷冻是否诱导未成熟卵母细胞凋亡通路的激活：将未成熟COCs分为阴性对照组(FOs组，n=31，新鲜COCs)、阳性对照组(HPOs组，n=32，100 μmol/L过氧化氢溶液暴露COCs约3 h诱导细胞凋亡)、2 h VIOs组(n=31，玻璃化复苏COCs 2 h)和18 h VIOs组(n=32，玻璃化复苏COCs 18 h)。由于在复苏后COCs可能开始缓慢闭锁，应在孵育后2 h及18 h(小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的标准时长)对VIOs进行分析。实验Ⅱ用于探讨Z-VAD-FMK对凋亡标志物(未成熟卵母细胞DNA片段化、Caspase活性)的影响：将COCs分为VIOs(-/-)组(n=36，正常玻璃化冷冻复苏培养基，未添加Z-VAD-FMK)、VIOs(+/-)组(n=37，添加20 μmol/L Z-VAD-FMK至玻璃化冷冻复苏培养基中)和VIOs(+/+)组(n=34，添加20 μmol/L Z-VAD-FMK至玻璃化冷冻复苏培养基和复苏后培养基中)，复苏后的VIOs孵育18 h，随后进行凋亡标志物检测。泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK购自美国MedChemExpress公司，其在所有玻璃化冷冻—复苏溶液和体外成熟培养液中的最终浓度为20 μmol/L[尽量使DMSO浓度低于0.1%(V/V)，以避免细胞毒性]。实验Ⅲ主要分析Z-VAD-FMK对VIOs体外发育潜能的影响：将COCs分为FOs组(n=130)、VIOs(-/-)组(n=129)和VIOs(+/+)组(n=128)，分组操作同上，评估VIOs的发育能力。

1.5 凋亡信号检测

采用Cell MeterTM TUNEL凋亡检测试剂盒(美国AAT Bioquest公司)和CellEventTMCaspase-3/7 Green检测试剂(意大利Thermo Fisher Scientific-Invitrogen公司)于38.5 ℃对卵母细胞进行染色，孵育1 h，检测未成熟卵母细胞DNA片段化(TUNEL阳性卵母细胞百分比)和Caspase活性；再用Hoechst33342或DAPI(0.01 mg/mL)进行复染以确定细胞核；载玻片用抗褪色试剂(FluoromountTMAqueous Mounting培养液)覆盖，在配备数码相机(AxioCamMRc5，德国Zeiss)的荧光显微镜(Axiovert 100，德国Zeiss)下观察，计算TUNEL阳性卵母细胞数量(细胞核区域显示亮红色荧光)以及Caspase活性(即绿色荧光)，使用成像软件ZEN 2.5 blue版(德国Carl Zeiss Microscopy)计算荧光强度。

1.6 体外胚胎培养[9]

卵母细胞于可控环境(39 ℃、5% CO2)及20 μL未成熟卵培养液(TCM-199培养基中添加3 mg/mL牛血清白蛋白、0.1 mg/mL半胱氨酸、1.4 mg/mL羟乙基哌嗪乙磺酸、0.25 mg/mL丙酮酸钠、0.6 mg/mL乳酸钠、0.15 mg/mL左旋谷氨酰胺、0.055 mg/mL庆大霉素、0.2 IU/mL人促黄体激素和0.5 IU/mL人垂体促卵泡刺激激素)中培养18 h；体外成熟培养液中培养18 h后，将卵母细胞从体外成熟培养皿中转移到50 μL新鲜体外受精培养基中，培养皿上覆盖矿物油。体外受精采用成年雄性小鼠常规睾丸切除术后获得的新鲜附睾精子。实验前睾丸于4 ℃中保存24 h，从睾丸中解剖附睾，从输精管和附睾尾中获取精子，用体外受精培养液重悬，30 μm过滤器过滤精子悬液，通过Bürker血细胞计数盘测定精子的运动状态和浓度；将精子悬液添加到含卵母细胞的微滴中至100 μL，最终运动精子浓度为1×106/mL。每个试管受精液中含有来自同一实验组的7～11个卵母细胞。卵母细胞和精子在可控环境中(39 ℃、5% CO2)共孵育。体外受精后，所有卵母细胞在体外培养(in vitro culture，IVC)培养基(Ham’s F-10中添加5%FBS、0.11 mg/mL丙酮酸钠、0.075 mg/mL左旋谷氨酰胺、0.6 mg/mL庆大霉素)中轻轻洗涤，使用剥离器微量吸液管去除精子和残余卵丘细胞后，将胚胎移至覆盖矿物油的IVC培养基中培养120 h。IVC期间，在高倍倒置显微镜下评估胚胎发育情况，每24 h 1次。

1.7 成熟率、受精率和胚胎发育率

体外受精 48 h后，用配有125 μm尖头的剥离器微量移液管机械置换未分裂的卵母细胞，与精子结合后置于载玻片上，于4 ℃、80%乙醇中固定过夜。然后通过碘化丙啶染色(1 mg/mL，1∶100)评估染色质构型。生长中的胚胎培养至120 h或出现闭锁迹象时，用碘化丙啶染色，根据卵裂球核的数量确定其发育阶段。未受精卵母细胞的成熟期(中期Ⅱ)通过存在一组紧密排列的染色体(第一极体)和另一组分布良好的染色体来确定。体外成熟卵母细胞总数为未受精成熟阶段卵母细胞、受精卵母细胞(即未分裂但显示原核)和卵裂胚的总和；受精卵母细胞的数量为受精卵母细胞和卵裂胚的总和。通过记录卵裂胚(2～4细胞、5～8细胞、9～16细胞)、桑葚胚和囊胚阶段评估胚胎发育情况，计算成熟率、受精率和胚胎发育率。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 玻璃化冷冻对未成熟卵母细胞凋亡通路的影响(实验Ⅰ)

HPOs组和18 h VIOs组未成熟卵母细胞DNA片段化比例高于FOs组(P<0.05)；18 h VIOs组DNA片段化比例低于HPOs组(P=0.004)，高于2 h VIOs组(P=0.023)；2 h VIOs组DNA片段化比例低于HPOs组(P<0.001)，但是与FOs组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。HPOs组、2 h VIOs组和18 h VIOs组Caspase活性(绿色荧光强度)均高于FOs组(P=0.001)，但是HPOs组、2 h VIOs组和18 h VIOs组Caspase活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

表1 未成熟卵母细胞DNA片段化和Caspase活性

a：TUNEL染色和Hoechst 33342染色(亮蓝色荧光表示细胞核，胞核中的亮红色荧光表示未成熟卵母细胞DNA片段化)；b：Caspase活性检测(绿色荧光表示Caspase活性程度，蓝色荧光表示DAPI核染色)

2.2 Z-VAD-FMK对凋亡标志物的影响(实验Ⅱ)

与VIOs(-/-)组相比，VIOs(+/-)组未成熟卵母细胞DNA片段化比例较低(P=0.007)。VIOs(+/+)组未成熟卵母细胞DNA片段化比例和Caspase活性低于VIOs(+/-)组和VIOs(-/-)组(P<0.001)，但VIOs(+/-)组和VIOs(-/-)组Caspase活性比较差异无统计学意义(P=0.588)，见表2。

表2 未成熟卵母细胞DNA片段化和Caspase活性

2.3 Z-VAD-FMK对VIOs体外发育潜能的影响(实验Ⅲ)

与FOs组相比，VIOs(-/-)组成熟率较低(P=0.004)，而VIOs(+/+)组成熟率与VIOs(-/-)组、FOs组比较，差异无统计学意义(P=0.384、0.060)。各组受精率比较，差异均无统计学意义(P=0.082)。VIOs(+/+)组和VIOs(-/-)组闭锁率高于FOs组(P<0.001)，但VIOs(+/+)组与VIOs(-/-)组比较差异无统计学意义(P=0.550)，见表3。此外，VIOs(-/-)组和VIOs(+/+)组的2～4细胞胚胎发育率比较差异无统计学意义(P>0.05)，但5～8细胞、9～16细胞胚胎发育率及桑葚胚发育率均低于FOs组(P<0.001)，各组2～4细胞胚胎发育率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；在胚胎发育后期，VIOs(-/-)组和VIOs(+/+)组均无囊胚形成，与FOs组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 VIOs成熟、受精和闭锁情况比较[个(%)]

表4 体外胚胎发育情况比较[个(%)]

3 讨论

为了克服VIOs的体外成熟和胚胎发育不良的问题，既往研究主要集中于改进玻璃化冷冻过程[4-6]。而本研究通过靶向凋亡途径证实了泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可抑制未成熟卵母细胞玻璃化冷冻诱导的DNA损伤和Caspase的活性，从而使VIOs的成熟率接近于新鲜卵母细胞的成熟率。

活性氧类物质(reactive oxygen species，ROS)是正常细胞氧化过程的副产物。精子、卵母细胞和胚胎都会积累大量ROS，从而导致线粒体损伤、三磷酸腺苷耗竭、细胞凋亡和发育障碍[10]，从而影响冷冻卵母细胞和胚胎的发育能力。本研究通过过氧化氢溶液诱导超低温保存的未成熟卵母细胞凋亡，结果显示未成熟卵母细胞DNA片段化超过90%。在卵母细胞凋亡过程中，Caspase发挥着关键作用。Caspase蛋白酶虽然可以裂解其他多种多肽成分，但是其本身通常也需要被其他酶(如级联中的其他Caspase)裂解才能激活[11]。Caspase活性增加导致一些细胞成分被破坏，从而激活典型的细胞凋亡途径。根据Caspase在级联反应中的功能，Caspase可分为启动子(如Caspase 8和Caspase 9)和效应子(如Caspase 3、Caspase 6和Caspase 7)[12]。本研究实验Ⅰ结果显示，无论孵育时间长短，VIOs组中Caspase活性均高于FOs组；2 h VIOs组与FOs组的未成熟卵母细胞DNA片段化比例相似，而18 h VIOs组未成熟卵母细胞DNA片段化比例明显高于FOs组。因此，在复苏后不久，Caspase的活性就可以被检测到，但有些酶可能需要更长的时间才能到达细胞核，并开始DNA片段化。关于细胞凋亡参与VIOs复苏后的闭锁机制在其他多个物种中也有报道[4-5]。我们推测，通过作用于凋亡级联反应成分可能有利于VIOs的生存和发育。本研究将Z-VAD-FMK用于COCs玻璃化冷冻复苏和/或玻璃化冷冻复苏及次日培养，结果显示，VIOs(+/+)组Caspase活性和未成熟卵母细胞DNA片段化比例低于VIOs(+/-)组，说明仅在玻璃化冷冻复苏过程中添加Z-VAD-FMK不足以避免DNA损伤，而在孵育18 h过程中再次添加Z-VAD-FMK可以显著降低Caspase活性，减少DNA损伤。这可能是由于Caspase抑制剂通过与Caspase的催化位点结合并抑制其活性而发挥作用，只在玻璃化冷冻复苏过程中添加Caspase抑制剂暴露时间较短，延长Z-VAD-FMK的时间有利于抑制凋亡通路的激活。Niu等[7]研究证实，体外培养玻璃化卵母细胞暴露于特定的Caspase抑制剂中可降低Caspase活性并提高发育能力，本研究结果与之一致。因此，Cryotop玻璃化结合IVM-IVF-IVC方案对低温保存的卵母细胞体外胚胎培养可能是一个很好的方案。然而，本研究发现在胚胎发育中，VIOs(+/+)组和VIOs(-/-)组受精率和闭锁率无统计学差异，发育后期进展较差，特别是桑葚胚和囊胚阶段，说明Z-VAD-FMK有利于体外成熟培养，可能是因为抑制剂的存在阻止了后期(即体外受精后)的闭锁[4,13-15]。另外，在培养过程中，不能进一步发育的胚胎细胞分裂停止并开始闭锁，而凋亡抑制剂的存在可能会抑制这一过程[16]。有研究发现，添加凋亡抑制剂至培养基可以提高胚胎发育率[17-18]。

此外，凋亡标志物的减少并不意味着发育能力的提高。由于目前没有一个阈值来区分健康和死亡细胞，荧光染色、免疫组化、PCR等方法均不能对Caspase活性进行绝对定量，DNA片段化的评估可能是对卵母细胞数量更好的评价方式。本研究结果显示，VIOs(+/+)组和VIOs(-/-)组未成熟卵母细胞DNA片段化和Caspase活性有统计学差异，但胚胎发育率无统计学差异，尤其在胚胎发育后期2组均无囊胚形成。说明完成胚胎形成所需要的前提条件远不止DNA的完整性。此外，由于VIOs暴露于Z-VAD-FMK中可抑制Caspase 8的活性，从而导致VIOs发生坏死性凋亡[17-18]。因此，无凋亡标志物增加并不意味着卵母细胞健康，胚胎发育不良可能是由于非凋亡变性所致。

综上，未成熟卵母细胞的玻璃化冷冻作用可导致DNA片段化和Caspase活性增加，而在玻璃化冷冻复苏和次日培养加入泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可有效逆转该过程。但是Z-VAD-FMK处理的VIOs体外成熟潜能和受精率与新鲜卵母细胞相似，因此Z-VAD-FMK可能对胚胎发育的影响较小，但需进一步研究证实。本研究通过靶向Caspase凋亡通路，可能为抑制细胞凋亡、增强VIOs的超低温耐受性和提高玻璃化冷冻未成熟卵母细胞发育能力提供思路。