超声处理对红豆蛋白理化性质及抗氧化功能的影响

安 宇，周欣雨，王 颖,2,3,，佐兆杭，孙 维，张乃丹，庞惟俏

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319；3.黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，黑龙江大庆 163319）

红豆（Vigna angularis）是豆科植物的一种，又称为小豆、赤豆等[1]。红豆营养价值较高，蛋白平均含量为25.2%，富含膳食纤维，矿物质和维生素种类丰富[2]，氨基酸种类齐全，必需氨基酸水平达到甚至高于FAO/WHO 的要求[3]。此外，其还具有的较高药用价值，如滋脾、益气、抗氧化和抑制肿瘤细胞增长等，同时可作为糖尿病患者食用的优选[4]，研发应用前景极为广阔。

虽然红豆蛋白营养丰富，但由于其乳化性等功能特性较差[5]，限制了其在食品工业的应用，因此，适度的改性处理可扩展红豆蛋白在食品工业中的应用[6]。目前有关红豆蛋白的改性方法有碱溶酸沉法、微射流、微波等方法。例如周伟等[7]研究指出，在pH＞5 的碱性条件、较低温度和NaCl 低浓度环境下均能提高小豆蛋白的功能特性。黄科礼等[5]采用微射流方法对红豆分离蛋白进行改性处理继而增强红豆蛋白理化与功能特性。但化学改性可能会产生或引入有毒物质或影响食品风味的物质，微波改性收益较低、成本较高。相较之下，超声波作为被公认为一项绿色技术，具有操作简单、实施方便[8]、成本低、能耗低[9]等优点。已有相关研究报道，超声处理可改变豌豆蛋白[10]、大豆蛋白[11]乳化性等功能特性，但目前关于利用超声技术，研究不同超声条件及超声前后对红豆蛋白理化性质及抗氧化能力影响的研究较少。因此，本研究以红豆蛋白为原料，研究了超声前后及不同超声参数工艺对红豆蛋白理化性质及抗氧化能力的影响，以期为红豆蛋白的开发应用提供相应的数据支持，具有现实理论意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂红豆蛋白（蛋白质量分数90%）三原天域生物制品有限公司；5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、乙二胺四乙酸 上海碧云天生物技术有限公司；甘氨酸 上海吉至生化科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷天津光复科技发展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美国Sigma 公司；T-AOC 试剂盒、铁离子还原力试剂盒 上海博湖生物科技有限公司；以上试剂 均为分析纯。

AR2140 电子天平 常州励岸宝机械设备科技有限公司；DL-360B 型超声波清洗机、FD-1A-50 型冷冻干燥机、JIDI-18D 型台式多用途高速离心机上海之信仪器有限公司；UV759 型紫外分光光度计 爱来宝医疗科技有限公司；PHS-3CpH 计 上海精密科学仪器有限公司；NLM100 均质机 上海人和科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红豆蛋白的超声处理 参考Tomotake 等[12]的方法制备样品，略有改动。取20 g 脱脂红豆蛋白粉分散在100 mL 蒸馏水中并搅拌均匀。参考文献[13-14]设置超声功率为160、400 W，超声时间为10、20、30 min，将蛋白溶液分别上述条件下进行超声处理。超声功率160 W 设为A 组，400 W 设为B组，样品分别标记为A1、A2、A3、B1、B2、B3。空白对照为不进行超声处理的干燥红豆蛋白粉。超声结束后，将样品平铺放入容器中，-80 ℃冰箱冷冻12 h后，冻干机干燥成粉末，于4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 红豆蛋白水解度测定 利用邻苯二甲醛（OPA）法对红豆蛋白进行水解度[15]测定。用紫外可见光分光光度计测定其吸光度（340 nm），注意OD 值要在精确反应2 min 后进行测定。按照下列公式进行计算：

式中：h 表示水解的肽键数；hhot表示总肽键数；SerineNH2表示mmol SerineNH2/g 蛋白；α、β分别用常数1.00、0.40 表示；X 表示待测样重量（g）；P 表示待测样中的蛋白含量（g/mL）；0.1 为待测样体积转换成L[16]。

1.2.3 红豆蛋白溶解度测定 采用双缩脉试剂法测量蛋白的溶解度[17]。同理测定总蛋白浓度，溶解度定义为上清液中蛋白浓度与总蛋白浓度的比值。

1.2.4 红豆蛋白游离巯基与二硫键含量测定 游离巯基含量：将10 mmol/L 5,5′-二硫代-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶解在0.1 mol/L Tris -甘氨酸缓冲液（2.5%SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）中得到Ellman’s 试剂。取50 μL DTNB缓冲液与2 mL 浓度为0.01 g/mL 的样品溶液混合，25 ℃避光反应30 min，紫外分光光度计测定吸光度（412 nm），以缓冲液为空白。

总巯基含量：将适量的蛋白质样品溶解于尿素-Tris -甘氨酸缓冲液（10 mol/L 尿素，2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）和β-巯基乙醇（β-Me；加入50 μL），摇匀后在25 ℃暗室孵育60 min。8000 r/min 离心20 min，将得到的上清溶于5 mL 浓度为12% 的TCA（w/v）中，重复3 次。离心后将沉淀溶解于2.5 mL 的Tris-甘氨酸溶液中，加入50 μL DTNB，25 ℃避光孵育30 min。最后，用紫外分光光度计在412 nm 处测量吸光度。巯基含量的计算公式如下：

式中：A412表示样品在412 nm 处减去空白后的紫外吸光度值；D 表示样品稀释倍数；C 为样品浓度（g/mL）。

1.2.5 红豆蛋白乳化性及乳化稳定性测定 乳化性及乳化稳定性的测定参考Wu 等[18]报道的方法。计算公式如下：

式中：θ表示乳化液中的油相体积分数（25%）；A0表示0 min 时混合液的吸光度值；A1表示0 min时混合液的吸光度值。

1.2.6 红豆蛋白起泡性及起泡稳定性测定 配制100 mL 蛋白质量分数为5%的蛋白分散液，8000 r/min转速下均质2 min（每20 s 停顿20 s，共均质6 次），快速转入量筒中记录刚转入量筒的泡沫体积V总，并分别记录在2、30 min 时的泡沫体积为V0、V30。

1.2.7 红豆蛋白抗氧化能力测定

1.2.7.1 红豆蛋白总抗氧化能力测定 取0.5 g 红豆蛋白加入50 mL 去离子水中，混合均匀。采用TAOC 试剂盒测定，结果表示为U/g。

1.2.7.2 红豆蛋白DPPH 自由基清除能力测定 参考张雪春等[19]的方法，略有改动。以无水乙醇为溶剂，配制浓度为2×10-4mol/L 的DPPH 溶液，于4 ℃冰箱备用。各加入0.5 mL 不同浓度的样品到4 mL的2×10-4mol/L DPPH 自由基溶液，摇匀室温下静置30 min。517 nm 下测定其吸光值A；同时测定4 mL 2×10-4mol/L DPPH 自由基溶0.5 mL 的60%乙醇混合液的吸光值Ac，计算公式如下:

1.2.7.3 红豆蛋白铁离子还原能力测定 取0.5 g 红豆蛋白加入50 mL 去离子水中，混合均匀。使用铁离子还原力试剂盒测定。

1.3 数据处理

实验均进行三次重复，结果以平均±标准偏差表示。利用Excel、SPSS 22.0 等进行数据的处理和分析，采用Origin 2018 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 超声处理对红豆蛋白水解度的影响

超声前后对红豆蛋白水解度的影响如图1。超声前后红豆蛋白的水解度差异显著（P＜0.05）。超声功率400 W 处理20 min（B2）时，红豆蛋白的水解度达到最大值21.3%。杜双奎等[20]研究表明，由于超声处理产生的空化效应会使蛋白质结构发生改变，蛋白质中活性部位暴露进而增加了水解度。但当超声功率不变，时间继续增加时，水解度开始下降。分析是因超声过度使暴露在外的蛋白质活性部位被破坏，导致水解度开始降低[21]。所以，适度超声处理可提高红豆蛋白水解度。

图1 不同超声条件对红豆蛋白水解度的影响Fig.1 Effects of different ultrasonic conditions on the degree of protein hydrolysis of adzuki bean

2.2 超声处理对红豆蛋白溶解度的影响

溶解度是蛋白质的重要性质之一[22]。如图2，与空白对照相比，超声处理显著提高（P＜0.05）了红豆蛋白溶解度，且随超声功率与时间增加而升高，当超声功率400 W 处理20 min（B2）时红豆蛋白的溶解度达到最大值76.65%。刁小琴等[23]研究指出，超声产生的空化作用和机械效应会将蛋白质大分子解聚为小分子，从而降低蛋白质粒径，增强蛋白质与水的相互作用，使蛋白质溶解度增加。刘昕等[24]研究表明，由于超声波使鹰嘴豆蛋白发生轻微变性，使蛋白结构疏松，疏水肽数量增加，从而使蛋白质溶解度提高。Zhong 等[25]指出，在不同温度不同时间加热对红豆蛋白溶解度没有太大的影响，相反，在热与超声共同作用下，随着处理温度和时间的增加，溶解度逐渐增加，所以认定超声是蛋白溶解度增加的主要原因。所以，合理范围的超声处理可显著（P＜0.05）提高红豆蛋白的溶解性。

图2 不同超声条件对红豆蛋白溶解度的影响Fig.2 Effects of different ultrasonic conditions on solubility of adzuki bean protein

2.3 超声处理对红豆蛋白游离巯基与二硫键含量的影响

不同超声条件对红豆蛋白中游离巯基与二硫键含量变化如图3 所示。由图3 可知，超声处理使芸豆蛋白中游离巯基含量显著增加（P＜0.05），二硫键的含量显著降低（P＜0.05）；与空白对照相比，当超声功率400 W 处理20 min（B2）时游离巯基含量最高，增加了3.12 μmol/g，超声功率400 W 处理30 min（B3）时二硫键含量最低，减少了1.35 μmol/g。赵城彬等[26]研究发现，超声处理5 min 时就可发现红豆蛋白中游离巯基含量显著增加（P＜0.05）。这是由于超声波产生的空化作用使蛋白质分子的颗粒减小，蛋白质内基团发生了改变[27]。研究表明，超声波破坏蛋白质内二硫键，分解成为新的游离巯基[28]。推测本实验中超声处理造成蛋白质内部巯基的暴露与二硫键的断裂，降低了蛋白质分子稳定性，从而导致红豆蛋白中游离巯基含量增加，二硫键含量减少。但当超声条功率400 W 处理30 min（B3）时，蛋白中游离巯基的含量开始减少。这是因为超声时间过长会产生过氧化氢，使游离巯基被氧化，进而降低游离巯基含量[29]。

图3 不同超声条件对红豆蛋白游离巯基与二硫键含量的影响Fig.3 Effects of different ultrasonic conditions on content of free sulfhydryl group and disulfide bond in adzuki bean protein

2.4 超声处理对红豆蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

乳化性代表蛋白质在水和油界面的吸附能力，而乳化稳定性是蛋白质在乳化液储存并留在油水界面的能力。乳化稳定性越高，则表示乳化性质越好[30]。如图4 所示，超声处理显著提高（P＜0.05）了红豆蛋白的乳化性及乳化稳定性，当超声条功率400 W 处理10 min（B1）时红豆蛋白乳化性及乳化稳定性达到最佳，与空白对照相比，分别提高了78.62%、43.94%。但当超声功率不变，时间继续增加时，乳化性及乳化稳定性开始显著下降（P＜0.05）。这是由于超声时间过长使蛋白质严重变性，被解聚成小颗粒的蛋白质重新聚集成大颗粒，从而降低它的乳化性[31]。杨柳等[32]研究发现，在设置功率240 W、时间10 min的超声处理下，红豆蛋白的乳化活性显著增强（P＜0.05），但当超声时间大于20 min 时，红豆蛋白乳化活性减弱。望运滔等[33]研究指出，超声处理会使鹰嘴豆分离蛋白的乳化性显著提高（P＜0.05）。所以，合理范围的超声处理能够显著增加（P＜0.05）红豆蛋白乳化性及乳化稳定性。

图4 不同超声条件对红豆蛋白乳化性及乳化稳定性的影响Fig.4 Effects of different ultrasonic conditions on emulsification and stability of adzuki bean protein

2.5 超声处理对红豆蛋白起泡性及起泡稳定性的影响

由图5 可知，超声处理显著增加（P＜0.05）了红豆蛋白起泡性及起泡稳定性。当超声条功率400 W处理10 min（B1）时红豆蛋白的起泡性及起泡稳定性分别达到最大值160.94%、74.37%。分析是超声处理产生的空化作用使蛋白质分子聚集程度减小而松散，使得蛋白质更易吸附在气-水界面上，增加了红豆蛋白的起泡性及起泡稳定性[34]。Xiong 等[35]表明了超声处理10 min 以上可显著增加豌豆蛋白的起泡性。望运滔等[33]研究到随着超声强度的增加，鹰嘴豆蛋白的起泡性显著增强（P＜0.05），超声处理20 min时，起泡性达到最大值。因此，适当的超声处理能够有效的提高红豆蛋白的起泡性及起泡稳定性。

图5 不同超声条件对红豆蛋白起泡性及起泡稳定性的影响Fig.5 Effects of different ultrasonic conditions on foamability and foamability stability of adzuki bean protein

2.6 超声处理对红豆蛋白抗氧化能力的影响

红豆蛋白的抗氧化能力如图6 所示，超声前后蛋白抗氧化能力差异显著（P＜0.05）。在超声条功率160 W 处理30 min（A3）时红豆蛋白总抗氧化能力最强，与空白对照相比增加了101.58%；DPPH 自由基清除能力与Fe 离子还原能力在超声条功率400 W处理10 min（B1）时达到最大值，与空白对照相比分别增加了78.23%、33.52%。Penta 等[36]发现蛋白质的抗氧化能力主要与组氨酸以及疏水性氨基酸有关，而贾俊强等[37]研究表明，超声波处理会加速蛋白质疏水性氨基酸外露。由此说明，超声处理可增加蛋白质的疏水性氨基酸基团数量，从而增加红豆蛋白的抗氧化能力。You 等[38]研究指出超声处理使红豆蛋白中含有的类似于组氨酸、苏氨酸等非特异性蛋白暴露在蛋白表面的数量增多，这些非特异性蛋白能够将Fe3+还原成Fe2+，从而提高红豆蛋白的Fe 离子还原能力。当超声功率不变，时间继续增加时，蛋白的三种抗氧化能力指标数值开始下降，推测是因超声时间过长，暴露氨基酸基团重新被掩埋，样品抗氧化能力降低。

图6 不同超声条件对红豆蛋白抗氧化能力的影响Fig.6 Effects of different ultrasonic conditions on antioxidant capacity of adzuki bean protein

3 结论

与空白对照相比，超声处理可以显著增强（P＜0.05）红豆蛋白的溶解度、水解度、乳化性及乳化稳定性、起泡性及起泡稳定性，超声处理使游离巯基含量增加，二硫键含量减少，且红豆蛋白抗氧化能力的三种指标均显著提高（P＜0.05）。但超声过度时，红豆蛋白的理化性质数值与抗氧化能力均会下降，因此，适度的超声处理可以使红豆蛋白理化性质及抗氧化能力提高。本研究为进一步探讨超声处理对红豆蛋白的理化性质及抗氧化能力奠定基础，为红豆等杂粮的开发与利用提供了理论依据。