低共熔溶剂提取江南卷柏穗花杉双黄酮的工艺优化

刘 超，黎维维, ，雷 杰，李 刚，卢德敏，徐大军，盛小娜，伍明江,，王 刚,

（1.遵义医科大学，贵州遵义 563000；2.遵义医科大学医学与科技学院，贵州遵义 563000；3.遵义医药高等专科学校，贵州遵义 563000）

江南卷柏为卷柏科卷柏属江南卷柏植物（Selaginella moellendorffiiHieron.）的全草[1]，味辛、微甘，性平。别名为岩柏草、石柏，在我国资源丰富，长江以南贵州、重庆、云南和四川等地均有分布[2]。其具有利尿通淋、活血消肿、止痛退热、清热解毒等功效，可用于治疗多种急慢性炎症以及出血等病症[3]。据报道江南卷柏中含有双黄酮类、酚类、甾体皂苷、木质素类等成分[4]，该植物的主要有效成分是双黄酮，其中含量最高的穗花杉双黄酮（Amentoflavone，AME）具有较好的抗肿瘤、降血糖、抗炎、扩张血管和抗病毒等[5]作用。

双黄酮类化合物传统提取通常采用碱提酸沉法[6]、加热回流提取法[7]、浸渍法[8]、渗漉法[9]，这些方法简单、易操作，但耗时长、提取得率低，且长时间热，对环境伤害极大，不利于环保。低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents,DESs），主要是由氢键受体氯化胆碱等与氢键供体有机酸和多元醇等组成的一种液体混合[10]。它可以作为一种对环境友好和可替代传统提取剂的溶剂，其原料便宜，制备简单，具有低蒸汽压、易生物降解等优点[11]。

DESs 提取江南卷柏中穗花杉双黄酮的研究目前未见文献报道。故本实验采用一步合成法制备了3 种低共熔溶剂，并结合超声辅助提取江南卷柏中穗花杉双黄酮，研究液固比、超声时间、超声功率等因素对AME 提取得率的影响，再利用响应面优化法对提取工艺进行再优化，以期对江南卷柏的开发利用提供相关参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

江南卷柏干药材 采购自贵州（批号：20201016），并经遵义医科大学生药学教研室张玉金副教授鉴定为江南卷柏（Selaginella moellendorffiiHieron.）的全草；穗花杉双黄酮标准品（纯度≥98%）瑞芬恩生物公司；氯化胆碱、香叶醇、芳樟醇、α-松油醇 均为分析纯，上海源叶生物科技有限公司；甲醇 分析纯，科龙化工试剂厂；对苯甲磺酸 分析纯，光复精细化工研究所；无水乙醇 分析纯，川东化工公司；乙腈 分析纯，上海试剂一厂；甲酸 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1260 型高效液相色谱仪、400MR DD2 型核磁共振仪 美国安捷伦公司；FA1004N 型电子天平菁海仪器公司；KQ118 型多频超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；N-1100 型旋转蒸发仪、OSB-2100 型水浴锅 上海爱朗仪器有限公司；DLSB-2L/-20 型低温冷却液循环泵 上海豫康科教仪器设备有限公司；FW177 型粉碎机 泰斯特仪器公司；Nicolet IS5 型傅里叶红外光谱 美国赛默飞世尔科技；Labsys evo 型热重分析仪 法国塞塔拉姆公司；TU-1901 型紫外可见分光光度计 普析通用仪器公司；SHB-III 型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DF-101S 型磁力搅拌器 郑州科华仪器设备有限公司；722 型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DES 溶剂的制备 选择氯化胆碱（Choline chloride）[12]为氢键受体（hydrogen bond acceptor，HBA），芳樟醇（Linalool）、香叶醇（Geraniol）和α-松油醇（Alpha-Terpineol）为氢键供体（hydrogen bond donors，HBD）[13]，按照一定摩尔比混合，在氮气保护下60 ℃搅拌至均匀的无色液体，制得不同DES 溶剂（表1）。

表1 不同类型的DES 溶剂Table 1 Different types of DES solvents

1.2.2 DES 溶剂的筛选 参考文献[14]中的提取方法，称取干燥粉碎的江南卷柏3 g，置于250 mL 锥形瓶中，加入DES 溶剂，液固比10 mL/g，提取时间30 min，超声功率240 W，以AME 提取得率来考察不同的低共熔溶剂、摩尔比及含水量（见表2），筛选出最佳低共熔溶剂、摩尔比和含水量。

表2 DES 溶剂的筛选Table 2 Screening of DES solvents

1.2.3 DES 溶剂的结构分析 核磁共振分析（NMR）：将30 mg DES 加入核磁管中，然后加入500 μL 氘代DMSO（C2D6SO）溶解，充分混匀后，用核磁共振仪进行1H-NMR 和13C-NMR检测。

傅里叶红外光谱分析（FT-IR）[15]：DES 及各组分的傅里叶红外光谱采用Shimadzu IR Affinity-1 进行检测。扫描范围为400～4000 cm-1，共扫描128 次。

热重分析（TGA）：使用TA Q600 热重分析仪，在氮气下进行，检测温度范围25～900 ℃，升温速率10 ℃/min[16]。

1.2.4 单因素实验 以最佳低共熔溶剂为提取剂，含水量20%，考察不同的提取条件（超声功率：160、200、240、280、320 W；液固比：5、10、15、20、25 mL/g；超声时间：10、30、50、70、90 min），HPLC 测定穗花杉双黄酮的提取得率，考察不同条件对提取效果的影响。

1.2.5 响应面试验 根据单因素实验结果，选择对AME 提取得率有显著影响的工艺参数：即液固比、提取时间和超声功率为单因素实验的最佳条件，根据响应面Box-Behnken 设计出试验方案，用Design-Expert 11.0 软件进行3 因素3 水平5 个中心点，设计出17 组随机的实验。使用二次多项式模型来评估响应值与三个变量即A、B、C 之间的关系，如表3。

表3 响应面试验因素水平设计Table 3 Response surface experimental factor level design

1.2.6 HPLC 色谱条件 色谱柱：Ascentis-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B）；检测波长：330 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；供试品进样量：20 μL。

1.2.7 AME 提取得率计算

式中：C 为江南卷柏中AME 的浓度，mg/mL；V 为江南卷柏提取液体积，10 mL；m 为江南卷柏药材总质量，g。

1.2.8 不同提取方法比较 冷浸法（Cold maceration extract,CME）：根据秦晶晶等[17]研究的方法，取3 g江南卷柏药材粉末，加入100 mL 95%乙醇，室温浸渍6 h，过滤，浓缩，甲醇稀释定容至10 mL，HPLC 分析，计算AME 得率。平行实验3 次。

热浸法（Hot maceration extract,HME）：根据韩秋菊等[18]的研究方法，取3 g 江南卷柏药材粉末，加入100 mL 95%乙醇，50 ℃下浸渍6 h，过滤，浓缩，甲醇稀释定容至10 mL，HPLC 分析，计算AME 得率。平行实验3 次。

乙醇超声提取法（Ethanol-UAE）：根据李洪玉等[19]的研究方法，取江南卷柏药材3 g 粉末，加入100 mL 95%乙醇，超声提取30 min，过滤，浓缩，甲醇稀释定容至10 mL，HPLC 分析，计算AME 提取得率。平行实验3 次。

离子液体超声提取法（IL-UAE）：根据李国峰等[20]的研究方法，取江南卷柏药材3 g 粉末，加入48 mL离子液体（[HMIM]·[PF6]）和12 mL 水，超声提取30 min，过滤，浓缩，甲醇稀释定容至10 mL，HPLC 分析，计算AME 得率。平行实验3 次。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 DES 溶剂的筛选

2.1.1 不同DES 溶剂影响 本文考察了不同DES（Chcl-Lin、Chcl-Ger、Chcl-Alp）提取江南卷柏中AME的提取得率的差异。结果如图1 所示，Chcl-Lin、Chcl-Ger、Chcl-Alp 对AME 的提取得率为Chcl-Ger＞Chcl-Lin＞Chcl-Alp，因此选择Chcl-Ger 为最佳低共熔溶剂。

图1 低共熔溶剂的筛选Fig.1 Screening of deep eutectic solvents

2.1.2 摩尔比的筛选 HBA 和HBD 的摩尔比是影响DES 理化性质的重要因素[21]。摩尔比差异会导致DES 粘度和表面张力差异[22]，进而影响目标分子的提取率。本文考察了Chcl-Ger 不同摩尔比（HBA:HBD=1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）对AME 提取得率的影响。结果如图2 所示，随着摩尔比从1:1 增加到1:2，AME 提取得率随之增大。这是由于HBD增加，使DES 粘度和表面张力降低，有利于的AME的传质和溶出，导致AME 提取率提高；当摩尔比从1:2 进一步增加到1:5 时，AME 的提取得率反而降低，这可能是由于HBD 过多导致DES 与AME 间的相互作用减弱。因此选择HBA:HBD=1:2 位最佳摩尔比。

图2 氯化胆碱:香叶醇摩尔比的筛选Fig.2 Screening of choline chloride:geraniol molar ratio

2.1.3 含水量的筛选 不同的含水量会导致DES 的粘度差异，进而影响DES 对目标物质的提取得率[23]。本实验考察了不同DES 含水量（10%、20%、30%、40%、50%）对AME 提取得率的影响。结果如图3所示，当含水量从10%增加至20%时，AME 提取得率随之增加；当含水量达到20%时，AME 提取得率最大；当含水量高于20%时，AME 提取得率反而降低，这可能是因为过大的含水量会导致DES 的粘度降低进而减弱DES 与AME 之间的相互作用。因此选择20%为最佳含水量。

图3 氯化胆碱:香叶醇含水量的筛选Fig.3 Screening of choline chloride:geraniol water content

2.2 Chcl-Ger 的结构分析

2.2.1 核磁共振分析 通过核磁共振分析对最佳的DES 进行了结构表征，Chcl-Ger 的13C-NMR 和1HNMR 如图4 所示。从图4A 可知，Chcl-Ger 中氯化胆碱碳原子的特征峰为67.3 和55.4 ppm，香叶醇碳原子的特征峰为17.97、57.91、124.42 和135.67 ppm；从图4 B 可知，Chcl-Ger 共有4 个特征峰，分别为归属于氯化胆碱氢原子的3.11 ppm 和归属于香叶醇氢原子的1.75、4.38 和5.40 ppm。通过与香叶醇和氯化胆碱的标准图谱对比可知Chcl-Ger 中碳原子和氢原子化学位移值与香叶醇和氯化胆碱的一致，说明合成Chcl-Ger 未发生化学反应，Chcl-Ger 为混合物。

图4 氯化胆碱:香叶醇、香叶醇和氯化胆碱的核磁共振谱图Fig.4 NMR spectra of choline chloride:geraniol,geraniol and choline chloride

2.2.2 傅里叶红外光谱分析 Chcl-Ger、氯化胆碱和香叶醇的FT-IR 光谱图如图5 所示。由图5 可知，香叶醇和氯化胆碱的νOH 峰（伸缩振动峰）在低共熔溶剂图中发生微弱的变化，氯化胆碱的δC-H 特征峰（弯曲振动峰）从1477 cm-1蓝移至低共熔溶剂1482 cm-1，香叶醇的δC-H 特征峰（弯曲振动峰）从1377 cm-1红移至低共熔溶剂1373 cm-1，氯化胆碱的νC-N峰（伸缩振动峰）从1012 cm-1蓝移至低共熔溶剂1026 cm-1。以上结果表明，Chcl-Ger 中具有强烈的氢键作用。

图5 氯化胆碱、香叶醇及氯化胆碱:香叶醇的红外光谱图Fig.5 Choline chloride,geraniol and choline chloride:geraniol spectra of geraniol

2.2.3 热重分析 Chcl-Ger 的热重分析结果如图6所示。由图6 可知，Chcl-Ger 存在三个失重阶段，第一阶段为室温到150 ℃，这部分的失重是由于DES中结晶水的释放所造成的，第二阶段为150 到300 ℃，在这一阶段几乎没有重量损失，表明Chcl-Ger 在这段温度范围有良好的热稳定性，温度高于300 ℃后，DES 开始剧烈失重，这可能是由于各个有机基团分解造成的。

图6 氯化胆碱:香叶醇的热重分析图Fig.6 Thermogravimetric analysis diagram of choline chloride:geraniol

2.3 单因素实验

2.3.1 超声功率的影响 由于超声波产生的空化作用和热效应会促使植物细胞的细胞细胞壁破裂，增加了目标物质的溶出。本文研究了不同功率（160、200、240、280、320 W）对AME 提取得率的影响。如图7a 所示，在160～240 W 的超声功率范围内，随着超声功率的升高，AME 提取得率显著增加，这可能是由于空化作用和热效应导致；当功率达到240 W时AME 提取得率最大；当功率大于240 W 时，AME提取得率随着功率的增加而减少，这可能是因为过大的功率产生了过多的杂质，而影响了AME 的溶出，因此选择超声功率240 W 用于之后研究。

2.3.2 液固比的影响 原料药材与溶剂的比率会影响AME 的提取得率，适当的液固比会增加其接触面积进而使得提取得率增加[24]。本文考察了液固比在5～25 mL/g 范围内AME 的提取得率，结果见图7b。当液固比低于10 mL/g 时，AME 提取得率随着液固比的升高而增加；当液固比达到10 mL/g 时，AME提取得率最大；但当液固比大于10 mL/g 后，AME提取得率随着液固比的升高而降低。其原因可能为过低的液固比会导致江南卷柏粉末与低共熔溶剂接触不充分，使得AME 的提取不完全，当液固比过高时，DES 扩散到植物细胞内部的距离过长，溶解更多的杂质，导致AME 提取得率降低。因此，本实验选择 10 mL/g 液固比进行后续研究。

2.3.3 超声时间的影响 提取时间会极大影响产物从植物中提取的效率，适当的提取时间才能尽可能使AME 被充分提取。本文考察了不同提取时间（10、30、50、70、90 min）对AME 提取得率的影响。由图7c 可知，在30 min 内AME 提取得率随提取时间的增加而增大；在提取时间为30 min 时，AME 提取得率最大；当提取时间高于30 min 后，AME 提取得率逐渐减小。这是由于过长的提取时间产生的机械效应或温热效应，导致了部分AME 的降解[25]，AME 提取得率降低。因此，本实验选择30 min 作为最佳提取时间。

图7 单因素实验Fig.7 Single factor experiments

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面优化AME 提取得率的结果 依据2.3 项下的单因素实验结果和Box-Behnken，利用Design-Expert 11.0 软件设计了3 因素3 水平5 中心总共17 组实验，三因素即超声功率（C）、液固比（A）、提取时间（B）。同时利用此软件分析实验结果，以AME（Y1）提取得率为响应值，Box-Behnken 分析结果如表4。

表4 Box-Behnken 试验结果Table 4 Box-Behnken experimental results

将此表中数据用Design-Expert 11.0 软件进行二次多元线性回归方程拟合，分别得到江南卷柏提取物中AME 提取得率响应面模型的二次多元线性回归方程分别为：Y1=2.8508+0.06525A+0.057625B+0.105625C-0.03125AB+0.04575AC+0.1345BC-0.7344A2-0.72115B2-0.61315C2。

2.4.2 Y1响应值的二次回归模型的方差分析 为验证二次回归方程所构建的数学模型及模型中所有的参数是否具有统计学意义，对多元二次回归模型Y1进行方差分析，由表5 可知，该二次回归模型F值为464.09（P＜0.0001），说明该回归模型显著，方案具有可行性；决定系数R2=0.9983，校正决定系数R2Adj=0.9962，说明此模型方程能具有较好的反应响应值。失拟值P=0.2086，表明模型失拟值差异无统计学意义（P＞0.05），从而反映该模型可对江南卷柏提取物中的AME（Y1）提取得率进行准确的分析及预测。由表5 可知，模型的一次项A、B、C，交互项BC 和二次项A2、B2、C2对江南卷柏中AME 的提取得率影响显著，影响实验响应值综合评分的F值分别为F（A）=19.84、F（B）=15.47、F（C）=51.99，各单因素对AME 得率得影响为：C＞A＞B，由此可知超声功率对江南卷柏提取物中AME 的提取得率影响较大。

表5 Y1 方差分析Table 5 Y1 analysis of variance

2.4.3 响应面分析优化 根据Design-Expert 11.0软件绘制的反映变量间交互关系的三维响应曲面（图8）。从AME 的3D 模型可以表示两个因变量如何影响测试结果，三维曲面图的横坐标表示任意两个变量，纵坐标表示AME 的提取得率。图中所示当超声时间和液固比交互影响时，固定A 或B 的值，随着另一个值的增大都能得到AME 得率呈现先上升后下降的趋势，虽然液固比和超声时间都能显著影响AME 提取得率（P＜0.05），但二者交互作用对响应值的影响并不显著（P＞0.05）。当超声时间保持在零水平时，固定超声功率或液固比任一值，AME 得率皆会随其中单个因素的升高而先升高后降低，超声功率和液固比都能对AME 得率产生显著影响，但交互作用对响应值的影响无显著性（P＞0.05）。当液固比为零水平时，超声时间和超声功率对AME 得率具有交互作用，固定B 或C 任一值，AME 得率随另一因素的升高而先升高，再趋于减少，交互作用显著（P＜0.001）。交互项对AME 得率的影响依次为：BC＞AC＞AB，且BC、AC、AB 之间的三维响应曲面均存在着最高点，说明响应值（Y1）具有最大值。

图8 响应面分析因素间相互作用对AME 提取得率的影响的3D 曲线图Fig.8 3D graph of response surface analysis factor inter-action interaction on AME extraction rate

2.4.4 验证结果 对Y1的二次回归方程求极值可以得到使得江南卷柏提取物中AME 提取得率可以达到最大值的提取条件：液固比10.23 mL/g，超声时间为30.94 min，超声功率为243.66 W，在此提取条件下AME 的提取得率可以达到理论最大值2.88 mg/g。提取条件实际调整为：液固比10 mL/g，超声时间为31 min，超声功率为240 W，在此条件下，AME 实际提取得率为（2.75±0.12）mg/g。

2.5 HPLC 色谱条件

在色谱条件下分别对江南卷柏提取物、AME 标准品、Chcl-Ger 低共熔溶剂进行检测，结果如图9所示。

图9 HPLC 色谱图Fig.9 HPLC chromatogram

2.6 不同提取方法比较

本文使用了4 种方法包括热浸法（Hot maceration extract,HME）、冷浸法（Cold maceration extract,CME）、离子液体超声提取法（IL-UAE）、乙醇超声提取法（Ethanol-UAE），与低共熔溶剂超声提取法（DES-UAE）比较其AME 提取得率的大小。如图10所示，DES-UAE 与传统的HME 和CME 相比，不仅能够节约近11 倍（229 min）的时间，其提取得率也分别增加了近10 和5 倍；与IL-UAE 和Ethanol-UAE相比，虽然提取时间相同，但是DES-UAE 法AME的提取得率分别增加了近2 和4 倍。因此，低共熔溶剂法能快速、高效、环保地提取江南卷柏中的穗花杉双黄酮，极大的拓宽了天然活性成分提取的途径。

图10 不同方法对江南卷柏中AME 提取得率的影响Fig.10 Influence of different methods on the content of AME in Selaginella moellendorffii

3 结论

本文依据DES 作为一种操作简便、简单易得、具有可设计性的特点，设计并合成了三种DES（Chcl-Lin，Chcl-Ger 和Chcl-Alp）用于提取江南卷柏中AME。筛选出摩尔比为1:2 和含水量为20%的Chcl-Ger 为最佳的DES。通过单因素实验得出，最好的提取条件为液固比10 mL/g，超声时间为31 min，超声功率为240 W，在此条件下，AME 实际提取得率为（2.75±0.12）mg/g。与乙醇超声提取法、冷浸法、热浸法和离子液体超声提取法这四种方法相比较，DES 法从江南卷柏中提取AME 的效果最好。以上结果表明DES 是一种快速高效、绿色环保的溶剂，极大拓宽江南卷柏的应用价值。本研究中筛选3 种二元DESs 考察AME 提取得率，今后可制备多种二元或者三元、多元的DESs 将其用于江南卷柏中更多活性成分的分离提取。