HPLC 法检测蜜饯中20 种合成着色剂含量

冉 丹，罗苏苏，张可欣，肖玥惠子，王淑霞，徐思敏，李 萌

（湖南省产商品质量检验研究院食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南长沙 410007）

合成着色剂又称合成色素，是一种重要的食品添加剂，可以改善食品色泽，较天然色素具有成本低、着色力好等优势，因而广泛被应用于食品工业[1-3]。在食品抽检过程中发现，合成着色剂在蜜饯产品中应用较多，如口味姜、猕猴桃果脯、杨梅凉果、芒果干等，一些蜜饯产品合成着色剂超标情况频频出现。而合成着色剂作为一种化工产品，长期食用对人体存在一定的潜在危害[4-6]。因此，为保障食品安全，蜜饯中合成着色剂的检测仍然是工作重点。

目前适用于测定蜜饯中合成色素的标准方法为GB 5009.35-2016[7]，该方法在蜜饯测定过程中存在诸多方面的问题[8-9]。该标准采用液液分配法和聚酰胺粉吸附法分别测定赤藓红和其他6 种合成着色剂，操作繁琐、耗时长，不利于实现批量检测。此外蜜饯样品在抽提过程中，其残渣极容易堵塞垂融漏斗，造成抽提困难，实验难以进行。聚酰胺粉吸附法操作不当，难以保证较好的回收率。

根据GB 2760-2014 规定[10]，我国允许在食品中添加的有机合成色素有11 种，分别为柠檬黄、日落黄、新红、苋菜红、胭脂红、亮蓝、赤藓红、酸性红、诱惑红、靛蓝、喹啉黄。就现有的标准检测方法来看[7,11-13]，均只覆盖部分产品类别和部分色素项目，难以满足实际检测需要。值得重视的是，和欧盟及其他国家法规相比较[14-16]，我国在合成着色剂方面的监管还存在滞后情况，例如我国专利蓝V、橙黄、丽春红S 等还并未纳入监管范畴，也没有相应的检测标准和方法，而在欧盟及其他国家已被允许应用于食品工业。国外一些关于此类新型色素已屡有报道，如2019年6 月输日食品违反日本食品卫生法的情况，通报了源产地为俄罗斯的点心专利蓝Ⅴ非法添加[17]；2020年12 月3 日，欧盟发布条例（EU）2020/1819，修订（EC）No 1333/2008 附件Ⅱ中关于在鲑鱼替代品中的色素使用规定[18]，其中就包含了橙黄和丽春红S。由此可见，面对品类繁多的新型合成着色剂，我国相应的法律法规及市场监管亟待完善。

目前关于色素的分析研究，已有很多文献报道，如刘珈伶[19]固相萃取法测定冰淇淋中6 种合成色素，唐一秋[20]采用色素专用柱测定茶饮料中9 种合成着色剂，夏宗艳等[21]采用90%丙酮作为提取剂，固相萃取法测定食品中8 种色素，高家敏等[22]采用高效液相色谱法同时测定饮料中12 种水溶性合成着色剂。但现有的文献基本都是基于特定的样品基础，选择性对部分色素类别进行研究，没有基于合成色素结构特性，开发具有普适性的检测方法。本研究旨在以蜜饯为样品基础，建立一个具有普适性的，可以检测同类型合成着色剂的方法，并可以扩展应用到其他食品类别。同时对前处理各关键影响因素进行探索研究，优化色谱条件，以实现复杂基质样品中合成色素准确、高效、高通量的检测分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

标准品：柠檬黄（CAS 1934-21-0，0.5 mg/mL）、新红（CAS 220658-76-4，1.0 mg/mL）、苋菜红（CAS 915-67-3，0.5 mg/mL）、日落黄（CAS 2783-94-0，0.5 mg/mL）、胭脂红（CAS 2611-82-7，0.5 mg/mL）、亮蓝（CAS 3844-45-9，0.5 mg/mL）、赤藓红（CAS 16423-68-0，纯度86.0%）、酸性红（CAS 3567-69-9，纯度87.4%）、诱惑红（CAS 25956-17-6，纯度86.0%）、酸性橙2（CAS633-96-5，纯度80.8%）、靛蓝（CAS 860-22-0，1.0 mg/mL）、丽春红S（CAS 6226-79-5，纯度91.4%）、喹啉黄（CAS 8004-92-0，纯度90.5%）、专利蓝Ⅴ（CAS 3536-49-0，纯度89.7%）、酸性红44（CAS 2766-77-0，纯度85.0%）、食品红1（CAS4548-53-2，纯度90.5%）、橙黄1（CAS 523-44-4，纯度88.3%）、酸性橙8（CAS 5850-86-2，纯度99.9%）、亮蓝G（CAS 6104-58-1，纯度91.4%）、酸性红50（CAS 5873-16-5，纯度60.6%）均购于上海安谱公司。

乙酸铵、无水乙醇、氨水（分析纯），甲醇、乙腈（色谱纯）国药集团；Inspire C18色谱分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）迪马科技有限公司；聚酰胺柱Cleanert PA（1 g/6 mL）天津博纳艾杰尔科技有限公司；混合型强阴离子反相固相萃取柱 ProElut PXA（150 mg/6 mL）、混合型弱阴离子反相固相萃取柱ProElut PWA（150 mg/6 mL）、混合型弱阴离子反相固相萃取柱ProElut PWA-2（150 mg/6 mL）迪马科技有限公司；混合型弱阴离子反相固相萃取柱Cleanert PWAX 柱（150 mg/6 mL）天津博纳艾杰尔科技有限公司；混合型弱阴离子反相固相萃取柱CNW poly-sery PWAX（150 mg/6 mL）、CNW polysery 色素专用固相萃取柱（500 mg/6 mL）上海安谱公司；样品材料口味姜、甜心金桔干、猕猴桃干、金梅姜等 源于抽检残余样品及市场采购。

岛津LC-20A 高效液相色谱仪（配DAD 检测器）岛津（中国）有限公司 ；Milli-Q 超纯水仪 德国默克密理博公司；VGT 超声波振荡仪 广东固特公司；M37610-33 涡旋振荡器 赛默飞世尔公司；SHZ-W 恒温水浴锅 常州万顺仪器制造有限公司；TD-6 高速离心机 万和仪器制造公司；HPD 24 位固相萃取装置 色谱科仪器公司；MTN-2800W 氮吹浓缩仪 天津奥特赛恩斯仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 样品取可食部分，经充分粉碎后混合均匀，称取5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL 具塞比色管中，加入20 mL 提取剂（甲醇:氨水=10:1，v/v），涡旋混匀后超声10 min，重复提取两次，上清液水浴蒸发至近干，3～5 mL 水少量多次溶解转移至15 mL离心管，加入100 μL 甲酸混匀，待净化。依次用5 mL甲醇、5 %甲酸水溶液活化混合型弱阴离子反相固相萃取柱ProElut PWA-2，将待净化液转移至萃取小柱，控制流速每秒1 滴，再依次用5 mL 5 %甲酸、甲醇淋洗，弃去淋洗液，用6 mL 5 %氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩至近干，流动相（甲醇:20 mmol/L乙酸铵=2:8，v/v）溶解定容至1 mL，过PTFE 膜，待测。

1.2.2 液相色谱参考条件 岛津LC-20A 高效液相色谱仪（配DAD 检测器）；色谱柱：Inspire C18色谱分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：254 nm/428 nm/509 nm/625 nm；流速：1.0 mL/min；流动相A 为甲醇，流动相B 为20 mmol/L 乙酸铵溶液，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.3 标准溶液 称取固体标准品各5.0 mg（按纯度折算后的质量），水定容至10 mL 容量瓶，配制浓度为0.5 mg/mL 标准储备液，新红、靛蓝液体标准品直接稀释至0.5 mg/mL，分别准确移取0.01、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 mL 标准储备液于50 mL 容量瓶中，水定容至刻度，配得浓度为0.1～20 μg/mL 系列标准工作液。按1.2.2 进行分析测定，记录线性方程及相关系数。

1.2.4 方法学考察 选择空白基质样品，分别加入不同浓度水平的标液，每个水平重复分析测定6 次，进行加标回收与精密度试验。以供试液响应最低项目的3 倍信噪比及10 倍信噪比确定检出限与定量限。

1.3 数据处理

通过与岛津LC-20A 仪器配套的Labsolution色谱处理软件完成数据采集分析，采用 Excel 软件进行图形绘制及处理，结果统计为 3 次平 行测定结果。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

提取是分析检测的第一步，也是关键步骤，如果提取溶剂选择不当，会直接影响目标物回收率。有文献提出采用水溶液超声提取[23]、亚铁氰化钾-乙酸锌-水溶液沉淀提取[24]、丙酮/水溶液提取[21]、乙醇/氨水/水溶液提取[25]、乙腈/氨水溶液提取[26]、甲醇/氨水溶液提取[27]等方法提取着色剂。本研究就以上各种提取溶剂进行了比较，以柠檬黄、胭脂红、日落黄、酸性橙2 四种极性有差异的合成着色剂为监测指标，以蜜饯加标样品作为分析对象，研究其提取效果及回收率，回收率为统计3 次平行试验结果值，如表2。

表2 不同提取溶剂的提取效果及回收率比较Table 2 Comparison of extraction effect and recovery rate with different extraction methods

以上结果表明，采用乙醇/氨水/水、甲醇/氨水两种提取溶剂时回收率较高、便于操作。通过分析合成着色剂分子结构式，发现除靛蓝外，赤藓红为苯甲酸钠结构，其他合成着色剂均为苯磺酸钠结构，而含此类酸性基团的色素更容易被碱性提取溶剂提取。采用乙腈/氨水提取，虽然回收率高，但因某些蜜饯样品可能会添加氯化钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、焦亚硫酸钠及糖类，产生盐析和糖析现象，应用范围存在局限。为进一步探索比较乙醇/氨水/水、甲醇/氨水两种提取方式，选取口味姜丝、芒果干及甜心金桔三种样品类型分别进行比较研究。试验发现，在检测分析甜心金桔干样品时，采用乙醇/氨水/水、甲醇/氨水两种提取溶剂，日落黄、酸性橙2 回收率差异不大，但乙醇/氨水/水提取，柠檬黄、胭脂红回收率很低，平行性很差，高低相差近10 倍，测试结果见表3。所以本研究提取液采用甲醇/氨水作为优化选择的样品提取液。

表3 不同提取剂对不同样品的色素回收率比较（%）Table 3 Comparison of colorant recovery rate of different extractants for different samples (%)

通过对不同比例甲醇/氨水进行试验，发现氨水比例越高，提取效果越好，结果见图1。但甲醇/氨水比例到达20:1 后，增加氨水比例，回收率影响并不明显，考虑到某些样品本身可能含有天然酸性物质，会中和少量碱，所以提取溶剂宜增大氨水使用比例。当甲醇/氨水比例为5:1 时，增加后续蒸发浓缩时长。故最终本文选择的甲醇/氨水比例为10:1。

2.2 固相萃取柱选择

现有国标多采用聚酰胺吸附法净化合成着色剂，该法成本低，但过程繁琐耗时，不利于实现批量检验。固相萃取技术是目前常用的净化手段，能有效提取目标物，在检测领域应用广泛。也有文献对固相萃取柱在合成着色剂方便的应用进行了探索，如刘秀娟等[28]采用HLB 柱净化饼干中合成着色剂；任荣军等[29]采用Cleanert-PWAX 柱净化中成药中合成着色剂；刘珈伶等[19]采用Oasis WAX 柱净化冰淇淋中合成着色剂。由于合成着色剂多为苯磺酸、苯甲酸类有机酸，若采用C18、HLB 硅胶基质SPE 柱，保留较弱，难以吸附，或在淋洗阶段被洗脱。结合色素结构特性，选择阴离子交换模式较为适宜，市面上阴离子交换柱类型较多，本试验选择国产3 个品牌7 种固相萃取小柱进行比较研究，分别为聚酰胺柱：Cleanert PA（1 g/6 mL），混合型强阴离子反相固相萃取柱：ProElut PXA（150 mg/6 mL），混合型弱阴离子反相固相萃取柱：ProElut PWA（150 mg/6 mL）、ProElut PWA-2（150 mg/6 mL）、Cleanert PWAX 柱（150 mg/6 mL）、CNW poly-sery PWAX（150 mg/6 mL），CNW poly-sery 色素专用柱（500 mg/6 mL）。本实验通过对同一加标样品加入甲醇/氨水进行提取，蒸发浓缩后加入甲酸，以保证待净化液偏酸性，再采用相同的淋洗和洗脱条件进行SPE 净化处理（见1.2.1），以测试7 种固相萃取柱对不同色素的回收率，统计3 次平行测试结果如下表4。试验表明聚酰胺柱Cleanert PA 对丽春红S、胭脂红、酸性红等保留性强难以洗脱；混合型强阴离子反相柱ProElut PXA 对所有色素有极强吸附保留作用；混合型弱阴离子反相柱ProElut PWA 比ProElut PWA-2 保留性更强，部分色素回收率偏低；CNW poly-sery 色素专用柱对亮蓝、专利蓝Ⅴ、亮蓝G 保留性较弱，在甲醇淋洗阶段被部分洗脱，回收率偏低。洗脱液氨水比例从5%提升到20%，聚酰胺柱和混合型强阴离子反相柱对部分色素仍有强保留，因此不适宜色素分析。不同的弱阴离子反相柱可能最优淋洗和洗脱条件有所差异，在本试验条件下，ProElut PWA-2、cleanert PWAX、CNW polysery PWAX 性能相当，各色素均有较好的回收。本实验建立的方法选择ProElut PWA-2 作为净化SPE 柱。

表4 不同固相萃取柱回收率比较（%）Table 4 Comparison of recovery rate with different solid phase extraction columns (%)

2.3 针式过滤器及色谱分析柱的选择

针式过滤器是实验室最为常见的、使用频率很高的耗材，多用于上机前最后一步净化处理。然而某些材质的针式过滤器对目标物可能存在吸附作用，直接影响最终回收率。目前市面上主要滤膜材质分为6 种，具体分类及性能如下表5 所示。为研究6 种滤膜（均选用0.45 um）对合成着色剂是否吸附作用，选用浓度为2.0 μg/mL 的混合标样进行测试。结果表明，尼龙膜对合成着色剂吸附作用最为明显，其他膜对赤藓红存在一定吸附，PTFE 膜对合成色素基本无吸附作用。

表5 不同滤膜材质类型及使用性能Table 5 Different material types of filter membrane and its application performance

色谱分析柱如选择不当，容易导致柠檬黄与新红分离度较差，通过优化条件也难以改善。本研究选用Inspire C18色谱分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）作为色谱分析柱，以甲醇-20 mmol/L 乙酸铵为流动相体系，通过优化条件，按表1 条件梯度洗脱，20 种合成色素30 min 可以完成很好分离，标准溶液色谱图见图2。

图2 标准溶液色谱图Fig.2 Standard solution chromatography

2.4 检测波长的选择

目前国家标准和文献方法检测波长多选用254 nm，但实际检测中发现复杂基质样品中大部分干扰物在254 nm 均有吸收，容易干扰积分判断。此外亮蓝、靛蓝、专利蓝Ⅴ在紫外区灵敏度很低，往往定量不准，难以满足实际检测需要。本实验采用可见波长进行定量分析，二极管阵列检测器（DAD）对20 种色素在200～800 nm 范围内进行全波长扫描，各种合成着色剂最大吸收波长见表6，综合考虑检测器通道的限制，最终选择428、509、625 nm 为定量波长。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围、检出限、定量限 将1.2.3 的系列标准溶液，按优化的色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合。结果可知，20 种合成色素在0.1～20 μg/mL 内均呈良好的线性，相关系数符合GB/T 27404-2008 中附录F.2 要求，不同种类合成着色剂的最大吸收波长、定量波长、线性方程及相关系数见表6。在本试验条件下对供试液进行稀释，以单位浓度峰面积响应最低的靛蓝3 倍信噪比确定检出限，10 倍信噪比确定定量限，结果如下表6。本方法检出限均可以达到GB5009.35-2016 检出限（0.5 mg/kg）要求。

表6 20 种合成着色剂最大吸收波长、定量波长、线性方程、检出限及定量限Table 6 Maximum absorption wavelength,quantitative wavelength,linear equation,detection limit and quantitative limit of 20 synthetic colorants

2.5.2 加标回收率、精密度 选择一未添加色素的口味姜作为空白基质，按三个浓度水平进行加标，分别为1.0、5.0 和50 mg/kg，每个水平重复分析测定6 次，计算回收率和相对标准偏差（RSD），结果如表7。实验结果表明，20 种合成色素在1.0 mg/kg 添加水平回收率为84.0%～101.7%，RSD 为1.6%～4.4%；5.0 mg/kg 添加水平回收率为90.1%～104.3%，RSD为1.3%～4.9%；50 mg/kg 添加水平回收率为90.2%～104.5%，RSD 为1.4%～5.3%。回收率及精密度符合GB/T 27404-2008 中附录F.1、F.3 要求。

表7 20 种合成着色剂不同添加水平的回收率和精密度（n=6）Table 7 Recovery and precision of 20 synthetic colorants with different additive levels (n=6)

续表7

2.5.3 实际样品分析 目前适用于检测蜜饯中合成着色剂的标准为GB5009.35-2016。为验证本实验方法，并进一步与标准检测方法进行比较分析，选择添加有合成着色剂的甜心金桔干、猕猴桃干和金梅姜作为分析对象，按步骤1.2 进行检测分析，结果如表8。试验结果表明，甜心金桔干检出胭脂红和日落黄，胭脂红超出GB2760-2014 限量标准0.05 g/kg；猕猴桃干检出柠檬黄和亮蓝；金梅姜检出胭脂红，超出GB2760-2014 限量标准0.05 g/kg。由表8 可见，采用本方法检测分析阳性样品，定量结果均高于国标方法，回收率更高，操作更加便捷，具有更好的优势。

表8 蜜饯中合成着色剂的检测方法比较（mg/kg）Table 8 Comparison of detection methods of synthetic colorants in candied fruit (mg/kg)

3 结论

本研究采用二极管阵列反相高效液相色谱对蜜饯中20 种合成着色剂进行分析检测。对不同提取试剂的提取效率进行比较优化，选择甲醇/氨水溶液作为样品提取液；对7 种不同的SPE 柱进行比较分析，选择混合型弱阴离子反相固相萃取柱进行样品净化；对不同过滤膜进行比较优选；对检测波长及仪器条件进行优化。从线性方程、检出限、定量限、回收率、精密度等方面进行方法学考察，并对不同品类的实际样品进行测试分析。结果表明，该方法操作便捷、稳定性好、回收率高，可以有效解决目前在蜜饯检测过程中遇到的困难，并可以参考应用于其他食品类别，为色素类检测标准的制订及修订提供参考依据。