茶多糖-茶多酚对D-半乳糖诱导的小鼠脑组织氧化损伤的改善作用

童鑫怡，韦 铮，陈 梅，程 鸿，黄先智，丁晓雯,

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.重庆市巴南区农产品质量安全中心，重庆 401320；3.西南大学科技处，重庆 400716）

氧化应激是机体遭受不利刺激时，体内产生过多的活性分子，但由于抗氧化系统成分未能完全进行清除，氧化物的产生和清除失衡，从而导致组织功能受到严重损伤[1-2]。氧化应激能引起多种组织包括心肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、脑组织、脊髓等的损伤[3]。

脑是中枢神经系统，是代谢最活跃的器官，其特征是需氧量较高[4]但抗氧化能力相对较低。NADPH氧化酶是活性氧生成的关键部位，脑血管对NADPH氧化酶类功能和活性敏感性较全身动脉系统更强[5-6]，因此，大脑可能更易受到氧化应激影响[7]。脑组织作为支配人的行为、接受各种信息的组织，对人的正常生活十分重要，脑组织长期受到损伤，可能会致残和致死[8-9]，人体健康受到威胁。若早期对氧化应激进行干预，可以显著改善脑组织的损伤[3]。因此，控制脑组织的氧化应激，对保持脑组织的健康具有重要意义。

茶叶除了具有清热降火、祛风解暑的多种传统养生食疗药理功效，还被证明具有降糖降脂等功能[10]。在对脑组织氧化损伤的保护方面，目前相关研究成果较多的一种茶叶活性成分主要是茶多酚，研究表明茶多酚对受到氧化损伤的脑组织具有保护作用，其机制与降低氧化应激反应有关，在干预氧化应激反应中，茶多酚对自由基的形成有抑制作用，并对改善抗氧化酶活性有良好效果[11-12]。茶多糖作为茶叶中重要的功能成分之一，被证实了其具有较强抗氧化性和生物活性，可清理多种活性自由基[13-14]，但关于茶多糖的相关研究成果报道相对较少。目前，在氧化应激损伤方面的科学研究中，生物大分子受到的活性氧化应激损伤一直是重要的研究热点领域，活性自由基在攻击生物大分子时会造成生物蛋白质、DNA 分子结构和功能的改变、脂质过氧化[15]等，并伴有疾病的发生。因此，本研究旨在探究茶多糖-茶多酚混合成分对生物大分子和抗氧化酶的氧化损伤干预探究其对脑组织氧化损伤的改善作用，从食疗方面干预调节脑组织的氧化应激，为相关功能性食品的开发奠定理论基础。同时，茶多糖经模拟胃肠消化后仍具有较强的抗氧化能力[16]，为动物试验及功能性评价提供了有利依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

基础饲料、SPF 级的4 周龄（平均质量20 g 左右）雄性昆明小鼠84 只 重庆医科大学实验动物中心（许可证号SCXK（渝）2018-0003）提供；茶多糖-茶多酚（茶多糖含量为56.93%，茶多酚含量为19.37%，蛋白质含量为0.096%，水分含量为9.67%，灰分含量为13.21%）湖南华城生物资源股份有限公司生产；D-Gal、PBS 缓冲液（0.01mol/L，pH7.2～7.4）北京索莱宝科技有限公司；蛋白质羰基（PCO）、晚期蛋白氧化产物（AOPP）、3-硝基酪蛋白（3-NT）、丙二醛（MDA）、8-异前列腺素（8-iso-PG）、8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）、5-羟基胞嘧啶（5-OH-DG）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）酶联免疫分析试剂盒 厦门嘉慧生物科技有限公司（LOT 202011）。

Symergy H1 酶标仪 美国基因公司；Allegra X-22R 型高速离心机 由贝克曼库尔特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养、造模及分组 按西南大学实验动物保护和使用规则进行实验饲养，饲养环境为相对湿度40%～60%，室温23±2 ℃，12 h 明暗交替，自由饮水，饲喂基础饲料。84 只昆明种雄鼠随机分笼，每笼5 只，适应性饲养1 周后，用苦味酸对小鼠个体进行标记，分出12 只小鼠为正常饲养对照组，一直继续喂饲基础饲料；其余小鼠每天同一时间腹腔注射0.1 mL/10 g·bw 的10%D-半乳糖[17-18]，持续45 d，建立小鼠氧化应激损伤模型。造模组和正常组小鼠血清的MDA 含量是否存在显著性差异，判断造模是否成功。如果不成功，继续喂饲D-半乳糖直到造模成功。

将造模成功后的小鼠随机分成模型对照组（灌胃与实验组同剂量的生理盐水）、阳性药物对照组（灌胃还原型谷胱甘肽，200 mg/kg·bw）、茶多酚对照组（灌胃50 mg/kg·bw）、茶多糖-茶多酚低剂量组（灌胃40 mg/kg·bw）、中剂量组（灌胃100 mg/kg·bw）、高剂量组（灌胃250 mg/kg·bw），每天同一时间段灌胃1 次，灌胃体积为0.1 mL/10 g·bw，持续45 d，实验剂量以及灌胃周期均按照预实验有完善结果确定。

1.2.2 脑组织样本采集及制备 灌胃45 d，小鼠停止饲喂饲料不禁水12 h，取血后的小鼠采用颈椎脱位法处死，解剖，取出小鼠脑组织，用冰冷的生理盐水进行冲洗去除表面多余血水，滤纸吸干表面水分，液氮进行速冻，于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

准确称取小鼠的脑组织样本0.2 g，加入PBS 缓冲液1.8 mL 匀浆，将匀浆液于4 ℃、3000 r/min 离心15 min，取出上清液于-80 ℃保存、备用。

1.2.3 相关指标测定 脑组织中PCO、AOPP、3-NT、8-iso-PG、8-OHdG、5-OH-DG、MDA、SOD、GPX水平测定，均按照试剂盒内说明书操作。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 茶多糖-茶多酚对小鼠脑组织生物大分子氧化损伤的影响

2.1.1 对小鼠脑组织蛋白质氧化损伤的影响 研究表明，ROS 易攻击蛋白质，直接或间接导致蛋白质结构和活性遭到破坏[19-20]。氧化应激会产生包括可逆和不可逆修复的各种蛋白质功能损伤，不可逆修复的蛋白质功能损伤包括羰基化合物的形成[21]，蛋白质羰基含量与某些疾病的可能发生程度具有密切相关性，因此蛋白质羰基含量通常是衡量蛋白质氧化损伤的标志[22]。AOPP 是氧化损伤产生的含二氢鸟氨酸的交联蛋白质产物[23]，是一种评估交联蛋白质产物氧化功能损伤的重要标志。3-NT 是硝化应激的关键产物，是一种蛋白质受到氧化损伤的特异性产物[24-25]，3-NT 水平也可以用于判定蛋白质氧化损伤程度。考察茶多糖-茶多酚混合功能成分作用下，实验小鼠脑组织上述3 个蛋白质氧化产物水平，结果见表1。

表1 茶多糖-茶多酚对小鼠脑组织PCO、AOPP、3-NT 水平的影响Table 1 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on PCO,AOPP and 3-NT in brain of mice

表1 显示，和正常组比较，模型组小鼠脑组织的PCO、AOPP、3-NT 水平分别增加了36.66%、15.94%、20.61%（P＜0.05），表明模型组小鼠发生了蛋白质氧化损伤；与模型组比较，茶多酚组小鼠脑组织的PCO、AOPP、3-NT 水平分别降低了19.69%、13.66%（P＜0.05）、12.39%（P＞0.05），实验剂量的茶多酚未能使3-NT 完全恢复到正常组水平，可使其他2 个指标与正常组呈现不显著差异（P＞0.05），表明茶多酚单独作用时对蛋白质氧化产生的硝化产物恢复力不够；茶多糖-茶多酚中、高剂量组小鼠脑组织的PCO 水平分别减少29.19%、22.95%（P＜0.05），AOPP 水平分别减少13.17%、15.23%（P＜0.05），3-NT 水平分别减少15.36%、15.29%，均与模型组形成显著性差异（P＜0.05），且恢复至正常组水平（P＞0.05）；与茶多酚组比较，茶多糖-茶多酚高剂量组使PCO、AOPP、3-NT 水平分别降低了4.06%、1.81%、4.96%（P＞0.05），总体趋势较茶多酚组是下降的，恢复力更强。上述结果表明，茶多糖-茶多酚高剂量组能有效使模型小鼠脑组织的PCO、AOPP、3-NT 水平下降并且恢复至正常水平，对小鼠脑组织蛋白质氧化损伤具有恢复作用，且作用效果优于同剂量茶多酚组。

2.1.2 对小鼠脑组织脂质过氧化的影响 许多生物大分子因受到氧化应激从而产生过量活性分子和生物大分子的严重的损伤，其中包括脂质[26]。MDA 是脂质氧化的最终代谢产物，其含量表现抗氧化系统的活性。8-iso-PG 是一种特异的通过花生四烯酸的自由基介导的非酶促过氧化产生的化合物，是体内脂质过氧化最具体的标志[27]，测定其水平用以精确评估脂质氧化损伤程度。考察茶多糖-茶多酚混合功能成分作用下，实验小鼠脑组织脂质过氧化指标水平的变化，结果见表2。

表2 茶多糖-茶多酚对小鼠脑组织MDA、8-iso-PG水平的影响Table 2 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on MDA and 8-iso-PG in brain of mice

表2 显示，和正常组比较，模型组小鼠脑组织的MDA、8-iso-PG 水平分别增加了46.16%、42.61%（P＜0.05），表明模型组小鼠发生了脂质过氧化。与模型组相比，茶多酚组小鼠脑组织的MDA、8-iso-PG 水平分别降低16.81%（P＞0.05）、20.44%（P＜0.05），而与正常组相比，实验剂量的茶多酚使8-iso-PG 恢复至正常水平，而未能使MDA 完全恢复至正常水平，表明茶多酚对脂质过氧化的修复能力不足；茶多糖-茶多酚中、高剂量组的MDA 水平分别降低17.68%、25.23%（P＜0.05），8-iso-PG 水平分别降低32.06%、23.15%，均与模型组形成显著性差异（P＜0.05）且恢复到正常组水平（P＞0.05）；与茶多酚组比较，茶多糖-茶多酚高剂量组使MDA、8-iso-PG 水平分别降低了10.12%、3.40%（P＞0.05），差异虽然不显著，但总体趋势是下降的，恢复力更强。上述结果表明，茶多糖-茶多酚高剂量组能有效使模型小鼠脑组织的MDA、8-iso-PG 水平下降恢复至正常水平，对小鼠脑组织脂质氧化损伤具有改善作用，且效果优于同剂量茶多酚组。

2.1.3 对小鼠脑组织DNA 氧化损伤的影响 DNA受到氧化，将产生大量碱基修饰产物[28]，8-OHdG、5-OH-DG 就是重要产物，测定其水平可以评价DNA氧化损伤的程度，结果见表3。

表3 茶多糖-茶多酚对小鼠脑组织8-OHdG、5-OH-DG水平的影响Table 3 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on 8-OHdG and 5-OH-DG in brain of mice

表3 显示，和正常组比较，模型组小鼠脑组织的8-OHdG、5-OH-DG 水平分别增加了49.15%、33.79%（P＜0.05），表明模型组小鼠DNA 发生了氧化损伤。和模型组比较，茶多酚组小鼠脑组织的8-OHdG、5-OH-DG 水平分别降低14.18%（P＞0.05）、18.44%（P＜0.05），而与正常组相比，实验剂量的茶多酚使5-OHDG 恢复至正常水平，但未能使8-OHdG 恢复至正常水平（P＜0.05），表明茶多酚对DNA 氧化损伤修复能力不足；茶多糖-茶多酚中、高剂量组小鼠脑组织的8-OHdG 水平分别降低36.59%、32.36%（P＜0.05），5-OH-DG 水平分别减少19.92%、28.63%，均与模型组形成显著性差异（P＜0.05）；与茶多酚组相比较，茶多糖-茶多酚高剂量组小鼠脑组织的5-OH-DG、8-OHdG 水平分别降低了12.50%（P＞0.05）、21.19%（P＜0.05），形成显著性差异。上述结果表明，茶多糖-茶多酚高剂量组能有效使模型小鼠脑组织的8-OHdG、5-OH-DG 水平下降且恢复至正常水平，对小鼠脑组织DNA 氧化损伤具有修复作用，其作用效果比同剂量茶多酚组更优。

2.2 茶多糖-茶多酚对小鼠脑组织酶类抗氧化剂的影响

SOD 是主要的抗氧化复合酶，其复合酶体系对氧自由基的大量清除抑制作用显著[29]，从而维持着体内氧化平衡。GPX 是调节活性氧水平的关键酶，使组织免受氧化损伤[30]，测定SOD、GPX 水平可以反映茶多糖-茶多酚作用下机体酶促抗氧化系统的抗氧化能力水平。结果见表4。

表4 茶多糖-茶多酚对小鼠脑组织SOD、GPX 浓度的影响Table 4 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on SOD and GPX in brain of mice

表4 显示，和正常组比较，模型组小鼠脑组织的SOD、GPX 浓度分别增加了29.00%、27.12%（P＜0.05），表明模型组小鼠发生了酶类抗氧化系统的损伤。和模型组比较，茶多酚组小鼠脑组织的SOD、GPX 浓度分别增加48.02%、29.35%（P＜0.05），且使SOD 恢复至正常组水平（P＞0.05），但未能使GPX 恢复至正常组水平（P＜0.05），表明茶多酚对抗氧化酶的抗氧化能力的恢复力不足；茶多糖-茶多酚中、高剂量组SOD 浓度分别增加34.63%、71.15%（P＜0.05），GPX 浓度分别增加28.60%、36.90%，均与模型组形成显著性（P＜0.05）差异，与茶多酚组相比，茶多糖-茶多酚高剂量组小鼠脑组织的SOD、GPX 浓度分别增加15.63%（P＞0.05）、5.84%（P＜0.05）。上述结果表明，茶多糖-茶多酚高剂量组能有效使模型小鼠脑组织的SOD、GPX 浓度上升恢复至正常水平，对恢复小鼠脑组织酶类抗氧化系统抗氧化能力具有显著效果，且作用效果优于茶多酚组。

3 讨论与结论

脑是人体内结构复杂、功能完善、调节人体生理活动的重要器官，耗氧量大但清除自由基能力不足[2]，机体在受到外界有害刺激[31]，如缺氧、出血、中毒等，易造成自由基积累，大量的活性自由基将损伤脑细胞的结构[32]，使脑细胞内外环境失衡，甚至造成脑细胞凋亡。体内自由基和其他化学有害基团产生过多时，会直接导致细胞线粒体功能受损[33]，促进生物大分子氧化损伤以及炎症发生。氧化应激会造成急性脑卒中、脑缺血、衰老等[34]疾病，脑组织长期受到损伤，会造成不可逆的后果。因此，控制并修复脑细胞的氧化损伤具有重要意义。

对保护脑组织损伤的研究[35]中证实，抗氧化剂通过清除过量的活性氧和降低生物大分子氧化产物水平改善氧化应激水平，从而对脑组织损伤起到修复作用。在对抗氧化酶抗氧化能力的研究中表明，抗氧化酶浓度越高，抗氧化能力越强[36]，本实验探究SOD和GPX 抗氧化酶指标水平的变化来反映茶多糖-茶多酚干预后抗氧化酶抗氧化能力的变化，结果中显示茶多糖-茶多酚复合物作用后，抗氧化酶SOD 和GPX浓度升高，对活性氧的清除能力提高，清除由于氧化应激反应产生的过量ROS，恢复其动态平衡，从而对氧化损伤具有一定的改善作用。

过量的ROS 通过一系列反应不断攻击生物大分子，包括蛋白质的修饰氨基酸以及肽键，使其发生变性[37]，脂质过氧化反应以及破坏DNA 链或改变DNA 空间构象[4]，导致DNA 功能丧失。实验中选取蛋白质、脂质、DNA 氧化产物作为考察指标，通过其水平的变化反映茶多糖-茶多酚作用效果。结果表明，茶多糖-茶多酚药物干预后，均能使小鼠脑组织蛋白质氧化产物PCO、AOPP、3-NT 水平，脂质过氧化物MDA、8-iso-PG 水平以及DNA 氧化产物8-OHdG、5-OH-DG 水平显著降低，表明生物大分子氧化损伤得到改善。这可能与茶多糖-茶多酚干预后，提高抗氧化酶活力，降低体内由于氧化应激引起的活性氧的产生和清除失衡产生的过多活性氧水平，减少对生物大分子的损伤[38]，从而改善氧化应激反应对机体造成的伤害。

本实验基于茶多糖在体内保持其抗氧化活性这一基础[16]，探究茶多糖-茶多酚混合物对生物大分子及酶类抗氧化系统氧化损伤的改善作用，结果发现，中、高剂量的茶多糖-茶多酚干预蛋白质、脂质、DNA 的氧化和抗氧化酶抗氧化能力，其效果优于茶多酚单独作用的抗氧化效果，推测茶多糖和茶多酚协同抗氧化，其机理还需后续进一步实验研究。

综上所述，茶多糖-茶多酚协同对实验小鼠脑组织氧化应激损伤具有改善作用，达到100 mg/kg·bw的中剂量后，其对脑组织生物大分子的氧化和抗氧化酶活力有很强的保护作用，能使测定的指标回到正常。本实验结果为后续深度开发利用以茶多糖-茶多酚为主的混合功能成分的保健食品、减轻脑受氧化损伤导致的一系列损伤以及改善健康水平状况具有重要意义。