固相萃取-超高效液相色谱法测定愈酚喷托异丙嗪颗粒中6种色素含量

江 舸，朱恒怡，谢 华，常艳波，吴 强△

1.四川省药品检验研究院 化学药品所(成都 610097)；2.四川省药品检验研究院 生物样本检测中心(成都 610097)；3.四川省药品检验研究院 业务科(成都 610097)

愈酚喷托异丙嗪颗粒(sulfogaiacol pentoxyverine and promethazine granules，SPPG)用于感冒或流感引起的咳嗽、咳痰，可用于小儿下呼吸道感染[1]。现行质量标准[2]中规定，处方中胭脂红的含量为0.15 g/kg。胭脂红的加入有助于改善儿童用药的顺应性，同时对生产过程中原辅料是否混合均匀有提示作用，但胭脂红属于偶氮类色素[3],偶氮化合物在体内可代谢生成亲电子产物，它与DNA和RNA结合可形成加合物而诱发突变[4]，同时胭脂红可被氧化产生自由基,从而造成DNA氧化损伤[5]，因此有必要控制该制剂中胭脂红的加入量，保证产品安全性。

目前，国内外在食品行业对色素有一套较为完善的控制体系，其检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法(ELISA)和电化学方法等[6-7]。SPPG的现行质量标准中均未收载胭脂红的检查项，考虑到该制剂中可能会使用其他红色色素代替胭脂红使用，因此建立了一种前处理简单、净化效果好、分析速度快、回收率高的胭脂红及其他常用红色色素定量分析方法，同时对6种色素进行检测,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

ACQUITY超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Empower2工作站(美国Waters公司)；HSS T3色谱柱(美国Waters公司，50 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；CPA255D电子天平(德国Sartorius公司)；Mill-Q Advantage A10超纯水仪(德国Merck Millipore公司)；PWAX SPE小柱(规格：150 mg/6 mL,美国Agela Technologies公司)；胭脂红对照品(德国Dr.Ehrenstorfer，批号40726，含量98.0%)、日落黄对照品[中国计量科学院，批号GBW(E)100003a，50 g/L]、新红对照品(德国Dr.Ehrenstorfer，批号30523，含量89.0%)、苋菜红对照品(中检院，批号510002-201401，含量87.4%)、诱惑红对照品(德国Dr.Ehrenstorfer，批号30523，含量100%)、偶氮玉红对照品(Dr.Ehrenstorfer，批号40725，含量92.0%)。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。132批SPPG为国家药品评价性抽验样品，来源于12家生产企业。

1.2 色谱条件

以HSS T3(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)为色谱柱；流动相A为10 mmol/L磷酸二氢铵水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱(表1)；流速为0.5 mL/min,检测波长为254 nm，柱温为30 ℃,进样量为5 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取胭脂红对照品118.90 mg、日落黄对照品50 mg、新红对照品13.85 mg、诱惑红对照品20.09 mg、偶氮玉红对照品23.28 mg、苋菜红对照品20.90 mg，分别置于100、100、10、10、10、10 mL容量瓶中，加水溶解,并稀释至刻度，摇匀，即得上述6种色素的对照品储备液。精密量取日落黄对照品储备液0.2 mL、新红对照品储备液0.1 mL、胭脂红对照品储备液0.1 mL、诱惑红对照品储备液0.05 mL、偶氮玉红对照品储备液0.05 mL、苋菜红对照品储备液0.05 mL，置同一10 mL容量瓶中，加入氨水-甲醇(1∶9,v/v)1.8 mL，混匀，加水稀释至刻度，摇匀。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取研细的样品约5 g，精密加水10 mL使溶解，待净化；将PWAX SPE小柱用6 mL甲醇和6 mL水活化后，上样，依次加入6 mL水和6 mL甲醇淋洗，然后用氨水-甲醇(1∶9,v/v)9 mL洗脱，洗脱液加水稀释至50 mL，经10 000 r/min，离心半径8 cm，离心10 min，取上清液进样分析。

1.4 定量方法

精密量取供试品溶液、对照品溶液各5 μL，分别注入超高效液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有与6个色素化合物峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算含量。

2 结果

2.1 专属性

取空白阴性原辅料(处方中除胭脂红外的辅料及原料)约5 g，按照“1.3.2”项下供试品溶液前处理方法制得空白阴性原辅料溶液，取“1.3.1”项下对照品溶液，按照“1.2”项下色谱条件实验，结果空白阴性原辅料溶液不影响6个色素化合物的测定，且6个色素化合物峰之间的分离度均>1.5，理论塔板数均>7 000(图1)。

图1 专属性色谱图

2.2 标准曲线

分别精密量取“1.3.1”项下胭脂红、日落黄、新红、诱惑红、偶氮玉红、苋菜红对照品储备液各适量，加入氨水-甲醇(1∶9,v/v)适量使其占配制溶液总体积的18%，加水稀释制成每1 mL中约含上述各色素1、5、10、20、40 μg的系列对照品溶液，按照“1.2”项下色谱条件测定，以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，进行线性回归，胭脂红回归方程为y=2.04×104x-5.27×103，R2为1.000 0；日落黄回归方程为y=2.35×104x-5.06×103，R2为0.999 9；新红回归方程为y=2.28×104x-6.97×103，R2为0.999 9；诱惑红回归方程为y=2.10×104x-5.15×103，R2为0.999 3；偶氮玉红回归方程为y=1.29×104x-4.95×103，R2为0.999 7；苋菜红回归方程为y=2.69×104x-5.78×103，R2为0.999 9。

2.3 检出限与定量限

精密量取“1.3.1”项下对照品溶液适量，用水逐级稀释后进样，分别以S/N为3和10作为检测限和定量限，结果胭脂红、日落黄、新红、诱惑红、苋菜红检测限为0.012 μg/L、定量限为0.038 μg/L，偶氮玉红检测限为0.021 μg/L、定量限为0.067 μg/L。

2.4 精密度实验

精密量取“1.3.1”项下对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录色谱图，6个色素化合物色谱峰面积RSD(n=6)均<0.35%，保留时间RSD(n=6)均<0.15%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验

精密称取同一批次(批号：161006)研细的样品6份，按照“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，测定6个色素的含量，计算得胭脂红平均含量为0.16 g/kg，RSD为0.28%(n=6)，日落黄、新红、苋菜红、诱惑红、偶氮玉红均未检出。

2.6 回收率实验

称取空白阴性原辅料约5 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，分别精密加入“1.3.1”项下日落黄对照品储备液0.2 mL、新红对照品储备液0.1 mL、胭脂红对照品储备液0.1 mL、诱惑红对照品储备液0.05 mL、偶氮玉红对照品储备液0.05 mL、苋菜红对照品储备液0.05 mL，加水稀释至刻度，摇匀，按照“1.3.2”项下供试品溶液的制备方法进行前处理，平行做6份，按照“1.2”项下色谱条件进样分析，以标准曲线法测定并计算回收率，胭脂红、日落黄、新红、诱惑红、偶氮玉红、苋菜红的平均回收率分别为99.6%(RSD=0.6%)、100.2%(RSD=0.2%)、100.6%(RSD=0.5%)、99.8%(RSD=0.3%)、97.8%(RSD=0.7%)、98.5%(RSD=0.8%)。

2.7 样品测定

按照拟定的6种色素含量测定方法对收集到的132批样品进行检测，采用外标法进行定量分析。结果12家生产企业中仅3家企业按照色素胭脂红的处方量0.15 g/kg进行投料，9家企业未按照处方量进行投料，且均低于胭脂红处方量投料(图2)，各生产企业样品中均未检出另外5种红色色素。

图2 132批样品中胭脂红含量分布图

3 讨论

有文献[8-10]报道，非法染色的中药材及中药饮片、食品中多种色素的检测方法较多见，但化学药品中作为药用辅料色素的分析方法却很罕见。本方法采用固相萃取-超高效液相色谱法测定SPPG中的6种红色合成色素，前处理方法简单，4 min即可完成6种色素的分离及定量分析，提高了实验室工作效率。

精密称取研细的样品适量，直接用水溶解后进样，未检测到6个色素化合物峰，推测是处方中蔗糖(956 g/kg)的大量存在干扰了色素的检出，采用固相萃取技术能有效除去样品中的蔗糖，且萃取后的溶液中存在的其他成分均不影响色素的分离检出。对收集到的132批样品全部进行了检测，结果发现同一生产企业不同批次的样品中胭脂红含量无较大差异，且均未发现使用其余5种红色色素替代胭脂红投料的情况。12家生产企业中有9家企业未按照胭脂红的处方量进行投料，其中有4家企业生产产品中胭脂红的投料量不足处方规定量的一半，存在未按处方生产的情况。SPPG可供儿童使用，儿童的肝肾功能还不健全，处方中使用的合成色素胭脂红可能对儿童身体造成一定损害。英国食品标准局2007年公布的一份研究报告[11]显示，儿童在饮用了含有胭脂红的饮料后，可能会出现行为冲动、注意力不集中等症状，且偶氮类色素体内代谢后存在致突变、致畸的可能。目前未查询到相关法规规定色素作为辅料在药品中的最大允许使用量，因此有必要进一步加大合成色素的毒理研究，制定出药品中胭脂红科学合理的处方用量，并采用本方法进行质量控制，保障儿童安全用药。

综上所述，该方法不仅可作为SPPG的补充检验方法，同时也可为其他药物中添加的红色色素测定提供参考方法和思路。