黄曲霉毒素B1对海鲈生长性能、体成分、肝脏组织结构及毒素残留量的影响

■陈 冰 黄 文 赵红霞 彭 凯

（广东省农业科学院动物科学研究所，广东 省畜禽育种与营养研究重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东 广州 510640）

饲料霉变以及植物性蛋白原料替代鱼粉导致水产饲料受霉菌毒素污染的概率增加[1]，因此霉菌毒素对水产动物生长和健康的影响引发社会广泛关注。水产饲料中常见的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、玉米赤霉烯酮等，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）是已知的最强致癌物之一，被国际癌症研究机构列为一级致癌物，其毒性和致癌性极强，尤其对动物肝脏的危害性较大[2]。然而，有关AFB1对动物生长和健康影响的研究主要集中在畜禽，在鱼或虾等水产动物上的报道较少。据报道，AFB1 对水产动物的生物学影响主要取决于饲料中AFB1的浓度以及动物的种类、年龄、营养状况和动物的生长环境[3]。不同动物种类及生长阶段对AFB1 的耐受性不同，导致相关研究结果不一致，很难得出明确结论。AFB1 对动物生长的抑制作用是其毒性的主要表现形式之一，其负面作用还包括损伤肝脏和破坏机体免疫系统[4]。饲料中添加AFB1 对罗非鱼[5]、草鱼[6]、鲤鱼[7]、斑点叉尾鮰[8]、胡子鲶[9]、虹鳟[10]、红姑鱼[11]、凡纳滨对虾[12]及异育银鲫[13]等水产动物生长及肝脏健康的影响已有报道，但相关研究仍未见在鲈鱼中进行报道。

海鲈（Lateolabrax maculatus）是我国南方地区养殖的优质肉食性鱼类品种之一，其生长速度快、营养价值高、味道鲜美，深受广大消费者青睐。2021年，我国海鲈养殖产量突破19 万吨[14]，市场前景十分广阔。相比杂食性鱼类，海鲈等肉食性鱼类对AFB1 的敏感性更强，耐受性更差[15]。AFB1 可在鱼类的肝脏和肌肉中累积[16]，从而进一步影响食品安全和人类健康。研究AFB1 对鱼类生长性能和肝脏健康的影响规律，有助于全面了解AFB1 对鱼类的生物学作用，为合理开发药物及科学研究提供参考。本试验旨在研究饲料中不同水平AFB1对海鲈生长性能、体成分、肝脏组织结构及肝脏和肌肉中AFB1残留量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

以鱼粉、酪蛋白和大豆浓缩蛋白为蛋白源，面粉为糖源，鱼油、豆油和大豆卵磷脂为脂肪源配制基础饲料，饲料组成及营养水平如表1所示。在基础饲料上分别添加0（G0 组）、0.1（G0.1 组）、0.5 mg/kg（G0.5 组）和1.0 mg/kg（G1.0组）的AFB1（Sigma，USA），配制4组等氮等脂饲料。所有饲料原料过60 目标准筛，混合均匀后通过SLX-80 型双螺杆挤压机制成2.0 mm 颗粒饲料，55 ℃烘干后冷却至室温，于-20 ℃冰箱中保存备用。饲料中AFB1 含量参照朱聪英等[17]方法测定，实测值为0、0.09、0.45 mg/kg和1.02 mg/kg饲料。

表1 试验饲料组成及营养水平（干物质基础，g/kg）

1.2 试验设计与饲养管理

试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究中心循环水养殖系统中进行。选择初始体重为（2.90±0.02）g的健康海鲈幼苗480尾，随机分为4组，每组3个重复，每个重复40尾，随机分配到12个圆柱形玻璃纤维桶（直径80 cm×高70 cm、容积350 L），分别投喂4组试验饲料。采取饱食投喂方式，每天投喂2 次（07：00 和19：00），每天记录饲料投喂量、死亡情况及水质情况，试验期为56 d。试验期间采取自然光照，水温25.5～27.7 ℃，盐度1‰，溶解氧浓度＞6.0 mg/L，氨氮浓度＜0.01 mg/L，亚硝酸盐浓度＜0.02 mg/L，pH 7.5～8.0。

1.3 样品采集与分析

养殖试验结束后，海鲈禁食24 h后采样。统计每缸中海鲈的数量和总重量，计算存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和饲料系数（FCR）。每缸随机取6尾鱼，测体重和体长，解剖取内脏，分离内脏团、肝脏和肠道并称重，计算肥满度（CF）、脏体比（VSI）和肝体比（HSI）。每缸随机取3尾鱼，测定全鱼的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量。每缸随机取3尾鱼，解剖取肝脏，立刻置于10%福尔马林固定液中保存，制备石蜡组织切片，经苏木精-伊红法染色，于显微镜下观察肝脏组织形态。每缸随机取3尾鱼，解剖取肌肉和肝脏，采用液相色谱-串联质谱法测定组织中AFB1的含量[18]。

饲料和全鱼体成分营养指标参照国标方法检测，其中水分含量采用105 ℃常压干燥法（参照GB/T 6435—2014）测定，粗蛋白含量采用凯氏定氮法（参照GB/T 6432—2018）测定，粗脂肪含量采用乙醚抽提法（参照GB/T 6432—2006）测定，粗灰分含量采用550 ℃灼烧法（参照GB/T 6438—1992）测定。

1.4 指标计算

存活率（SR，%）=100×终末鱼尾数/初始鱼尾数摄食量（FI，g/尾）=摄食饲料总量（g）/[（初始鱼尾数+终末鱼尾数）/2]

增重率（WGR，%）=100×[终末体重（g）-初始体重（g）]/初始体重（g）

特定生长率（SGR，%/d）=100×[ln终末体重（g）-ln初始体重（g）]/饲养天数

饲料系数（FCR）=摄食饲料总量（g）/[终末体重（g）-初始体重（g）]

蛋白质效率（PER，%）=100×[末体重（g）-初体重（g）]/[摄入饲料总量（g）×饲料粗蛋白含量（%）]

肥满度（CF，g/cm3）=100×体重（g）/[体长（cm）]3

脏体比（VSI，%）=100×内脏团重（g）/体重（g）

肝体比（HSI，%）=100×肝脏重（g）/体重（g）

肠体比（ISI，%）=100×肠重（g）/体重（g）

1.5 数据处理与分析

采用SPSS 17.0 统计软件中单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s 法均值多重比较法对试验结果的差异显著性进行分析处理。先对数据进行方差齐性检验，若不满足方差齐性，则采用Dunnett-T3检验法进行多重比较。采用多项式比较分析均值的线性和二次方效应，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加AFB1对海鲈生长性能的影响（见表2）

表2 AFB1对海鲈生长性能的影响

由表2 可知，饲料中添加AFB1 不影响海鲈存活率、饲料系数及蛋白质效率（P＞0.05）。与G0组相比，G1.0组海鲈的末体重、增重率和特定生长率呈线性和二次方效应显著下降（P＜0.05），G0.5组和G1.0组海鲈的摄食量呈线性和二次方效应显著下降（P＜0.05），肥满度和肠体比呈线性效应显著下降（P＜0.05），G0.1、G0.5组和G1.0 组海鲈的脏体比呈线性效应显著下降（P＜0.05），肝体比呈线性和二次方效应显著下降（P＜0.05）。

2.2 饲料中添加AFB1对海鲈全鱼体成分的影响（见表3）

表3 AFB1对海鲈全鱼体成分的影响（湿基，%）

由表3 可知，饲料中添加AFB1 不影响海鲈全鱼的水分、粗蛋白、粗脂肪及灰分含量（P＞0.05）。

2.3 饲料中添加AFB1 对海鲈肝脏组织形态的影响（见图1）

图1 饲料中添加AFB1对海鲈肝脏组织形态的影响

由图1 可知，G0 组海鲈肝细胞形态结构正常，胞核结构清晰，肝细胞无变性和坏死。G0.1～G1.0 组肝细胞出现不同程度的变性和坏死，表现为肝细胞空泡化（红色箭头）、肝细胞形态模糊或消失（蓝色箭头），且随着饲料中AFB1 含量的增加，肝细胞出现变性和坏死的程度越严重。

2.4 饲料中添加AFB1 对海鲈肌肉和肝脏组织中AFB1残留量的影响（见图2）

由图2 可知，G0 组海鲈肌肉和肝脏中均未检出AFB1。与G0 组相比，G0.1～G1.0 组海鲈肌肉中AFB1含量显著增加（P＜0.05），G0.1、G0.5 组和G1.0 组海鲈肌肉中AFB1 含量无显著差异（P＞0.05）；随着饲料中AFB1含量的增加，海鲈肝脏中AFB1含量增加，与G0组相比，G0.1组和G0.5组海鲈肝脏中AFB1含量显著增加（P＜0.05），但二者之间AFB1 含量无显著差异（P＞0.05）；G1.0组海鲈肝脏中AFB1含量显著高于其他组（P＜0.05）。

图2 饲料中添加AFB1对海鲈肌肉和肝脏组织中AFB1残留量的影响

3 讨论

3.1 饲料中添加AFB1对海鲈生长性能的影响

AFB1 对鱼类的生物学影响主要取决于AFB1 在饲料中的浓度以及鱼的种类和年龄[3]。黄莹等[16]报道，饲料中AFB1浓度越高，其对鱼类的毒性作用则越强。相对于杂食性鱼类和成年鱼，肉食性鱼类和幼龄鱼苗对AFB1更加敏感，耐受性也更差[15]。研究表明，AFB1 对舌齿鲈（Dicentrarchus labraxL.）的半致死浓度LC50（口服，96 h）为180 μg/kg体重[3]，而其他鱼类的LC50为300～900 μg/kg体重[19]。不同鱼类对AFB1耐受性的差异主要取决于鱼类肝脏对AFB1的代谢能力[20]。根据我国现行饲料卫生标准GB/T 13078—2017规定，鱼类配合饲料中AFB1 含量须小于或等于20 μg/kg。本试验饲料中AFB1 的添加量为0.1～1.0 mg/kg，该剂量远大于20 μg/kg，主要原因是研究高浓度AFB1 对海鲈的急性应激作用。本试验结果表明，饲料中添加0.1～1.0 mg/kg AFB1 不同程度地降低了海鲈的增重率、特定生长率和摄食量等生长性能指标，说明饲料中添加AFB1可抑制海鲈生长。这与Deng等[5]在罗非鱼、Zeng等[6]在草鱼、Tasa等[7]在鲤鱼、Jantrarotai等[8]在斑点叉尾鮰、Amjad 等[9]在胡子鲶、Arana 等[10]在虹鳟、郑宗林等[11]在红姑鱼、王静等[12]在凡纳滨对虾、黄莹等[13]在异育银鲫上的研究结果相似。AFB1对鱼类生长的抑制作用是其毒性的主要表现形式之一，其负面作用还包括损伤肝脏和破坏免疫系统[4]。肝脏被认为是AFB1的主要作用器官，鱼类摄入的AFB1经肝脏细胞色素P450 家族成员代谢转化为致癌物，诱发肝功能受损和代谢紊乱，从而抑制动物生长[13]。本试验结果表明，饲料中添加AFB1 导致海鲈肝脏组织结构受损，并诱发了肝细胞变性和坏死，而肝体比下降则说明AFB1影响肝脏器官发育。黄莹等[13，16]、王静等[12]和Zeng 等[6]也将鱼类生长性能的下降归因于AFB1 对肝脏产生的毒害作用。

3.2 饲料中添加AFB1对海鲈肝脏组织结构的影响

尽管AFB1 被认为损害草鱼[6,13]、鲤鱼[21]、凡纳滨对虾[12]、斑节对虾[22-23]、斑点叉尾鮰[8]、虹鳟[10]等水产动物的肝脏组织结构，但饲料中不同剂量的AFB1 对海鲈肝脏组织结构的影响还未见报道。本试验结果表明，随着饲料中AFB1含量的增加，海鲈肝细胞出现不同程度的变性和坏死，脂肪空泡化严重，说明AFB1损伤海鲈肝脏。史莹华等[24]报道，AFB1 在肝脏中经细胞色素P450 氧化酶代谢转化为黄曲霉毒醇，而黄曲霉毒醇又经过一系列生物活化步骤转化为AFB1-8,9-环氧化合物，后者具有很强的亲合性，极易攻击酶蛋白分子亲核上的氮、氧、硫等原子，使酶蛋白活性丧失，同时产生大量自由基和活性氧，得不到及时清除，肝细胞受自由基和活性氧攻击而诱发DNA 氧化损伤，最终导致肝脏组织结构损伤。Allameh 等[25]研究表明，AFB1 降低肉鸡肝脏脂肪代谢基因PPARα表达量，从而导致脂肪代谢紊乱而增加肝脏脂肪堆积。刘艳丽等[26]报道，当肝脏受损时，肝细胞中线粒体氧化酶系统遭到破坏，ATP 生成量减少，细胞膜的钠泵发生功能障碍，细胞内钠离子含量升高，水分进入细胞增多，细胞肿大或形成水泡变性。

3.3 饲料中添加AFB1 对海鲈肌肉和肝脏组织中AFB1残留量的影响

有关AFB1在畜禽动物组织器官中积累的研究较多，但在水产动物上的报道较少。黄莹等[13]报道，当饲料中添加5～500 μg/kg AFB1时，异育银鲫肌肉和性腺中的AFB1 积累量低于美国食品药品监督管理局（FDA）食品安全限定标准5 μg/kg，肝脏中的AFB1 积累量与饲料中的AFB1 水平呈对数关系，当饲料中AFB1添加量大于50 μg/kg时，异育银鲫肝脏AFB1的累积量则超过FDA 食品安全限定标准。黄莹等[16]研究表明，草鱼幼鱼至少可耐受AFB1含量达5 000 μg/kg饲料，摄食AFB1 小于1 000 μg/kg 的草鱼幼鱼肌肉中未检测出AFB1残留，仅在5 000 μg/kg 试验组检测出草鱼肌肉中含有大约1.2 μg/kg AFB1，此含量低于FDA 食品安全限定标准。本试验结果表明，饲料中AFB1 可在海鲈肌肉和肝脏中积累，但累积量均低于FDA食品安全限定标准，随着饲料中AFB1含量增加，海鲈肌肉中AFB1残留量无显著变化，而肝脏中AFB1残留量显著增加。这与郑宗林等[11]在红姑鱼和Deng等[5]在罗非鱼上的研究结果相似，随着饲料中AFB1含量增加，肝脏中AFB1残留量显著增加，但不影响肌肉中AFB1的残留量。本试验结果表明，AFB1在海鲈肝脏中的积累量高于肌肉，这可能与肝脏是AFB1 的靶器官以及代谢转化的主要场所有关[24]。

4 结论

饲料中添加0.1～1.0 mg/kg AFB1 可降低海鲈生长性能，导致肝细胞出现变性、坏死和脂肪空泡化现象。海鲈肝脏中AFB1 残留量高于肌肉，且与饲料中AFB1添加量成正相关。