螺旋藻多糖对猪伪狂犬病毒感染小鼠血清中氧化应激相关因子的调节作用

■王新蕊 曹迷霞 宾秀娟 季 露 韦英益 于美玲 覃志彪 胡庭俊

（广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005）

螺旋藻多糖（Spirulina platensispolysaccharide，PSP）为一种胞内酸性杂多糖，主要是由D-葡萄糖、D-半乳糖及葡萄糖醛酸等通过糖苷键连接而成的生物大分子[1]。现在已有的许多研究报道了螺旋藻多糖具有抗病毒活性[2]、增强免疫应激活性[3]、抗凝活性[4]以及清除自由基的活性[5]。当体内自由基和过氧化物产生过多而导致过氧化反应发生时，可通过电子转移、氢原子的传递以及金属耦合等作用清除多余的自由基和过氧化物，从而使机体氧化和抗氧化状态达到平衡[6-7]。还可以通过对自由基的清除从而产生超氧阴离子的抑制，还可以调节超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等，并通过与金属离子螯合来阻止自由基，从而防止脂质过氧化[8]。而自由基清除能力的下降可能会损伤细胞膜、线粒体，致使机体中的大分子被氧化从而产生对机体有害的物质[9-10]。Zhu等[11]的研究证明了从深枣果实中分离纯化的果胶多糖可以保护RAW264.7细胞免受H2O2诱导的氧化应激，从分子层面揭示了其重要的抗氧化活性，Shi等[12]发现松果菊多糖可以通过抑制炎症、氧化应激和丝裂原活化蛋白酶（MAPK）信号通路减轻脂多糖诱导的急性肾损伤。不仅如此，山豆根多糖[13]和马尾藻多糖[14]同样具有抗氧化作用。

猪伪狂犬病毒（PRV）属α-疱疹病毒亚科，目前PRV 基因产物中几乎有一半是成熟病毒体的结构成分[15]。这样的结构造就了PRV的强致病力、多样传播途径和具有感染潜伏期，使其成为了我国养猪场中流行最严重的传染病病原之一。施开创等[16]为了调查研究2018年广西猪群疫病的流行情况，检测了694份组织样品，其中PRV的阳性感染率为5.19%。王怀禹等[17]为调查研究2018年和2019年南充地区猪场的疫病流行情况，检测了1 857份血清样品和152份临床病例，其中PRV的阳性感染率为18.42%。鲁富有等[18]为调查研究云南省普洱市的PRV感染情况，检测了2 035份血清样品，其结果显示PRV阳性感染率为1.92%，因此，利用中药治疗以调节机体的免疫系统显得尤为重要[19-20]。文章研究中药多糖作用于PRV感染后的小鼠，利用氧化因子作为指标探究其引起的氧化应激反应，为螺旋藻多糖的抗氧化活性研究补充理论知识。

1 材料与方法

1.1 螺旋藻多糖组分1（PSP-1）和病毒

PSP-1 溶液：PSP-1 是经过酶解水提法得到的PSP，先后经过DEAE-52 纤维素层析柱和Sephacryl S-200凝胶层析柱分离纯化后得到的PSP-1。准确称取PSP-1 溶解于灭菌生理盐水，调节成所需浓度，经0.22 μm滤膜过滤除菌，现配现用。

猪伪狂犬病毒（PRV）溶液：PRV-GXLB-2013 株由广西大学动物科学技术学院预防兽医学教研室分离鉴定并保存。经PK-15细胞扩增病毒，用灭菌生理盐水稀释成所需浓度（10-5倍）（TCID50=10-7/mL）。

PK-15 细胞：为猪肾传代细胞系，由广西大学动物科学技术学院兽医药理实验室冻存。

1.2 试验动物

无特定病原体（SPF）级BALB/c 小鼠，雌雄各半，体重（20±2）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司[许可证号：SCXK（湘）2019-0014]。所有试验动物饲养于已消毒的鼠笼，12 h 光照、12 h 黑暗的光周期环境下，饲养温度恒定在（22±2）℃，购买后暂养3 d 使其充分适应环境，以减少应激，并让其自由采食及饮水，小鼠于试验开始前12 h禁食，提前6 h禁水。

1.3 试剂

一氧化氮（NO，批号：20200812）；诱导型一氧化氮合酶（iNOS，批号：20200811）；丙二醛（MDA，批号：20200813）；超氧化物歧化酶（SOD，批号：20200811）；过氧化氢酶（CAT，批号：20200813）；髓过氧化物酶（MPO，批号：20200812）；黄嘌呤氧化酶（XOD，批号：20200812）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号：20200807），试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 分组及处理

将120 只BALB/c 小鼠随机分为5 组，每组24 只，雌雄各半。分别为A组（200 mg/kg·BW PSP-1）、B组（100 mg/kg·BW PSP-1）、C组（50 mg/kg·BW PSP-1）、D组（PRV）、E组（对照组）。A～D组第1天经腹腔注射PRV 溶液，0.2 mL/只；随后第1～6 天分别灌胃高剂量PSP-1（200 mg/kg·BW）、中剂量PSP-1（100 mg/kg·BW）、低剂量PSP-1（50 mg/kg·BW）、灭菌生理盐水，0.2 mL/只，第7天剖杀。E组：第1天经腹腔注射灭菌生理盐水，0.2 mL/只；第1～6天灌胃灭菌生理盐水，0.2 mL/只，第7 天剖杀。PRV 感染前停食12 h，停水6 h，感染后按常规饲养，于感染后第7天剖杀进行后续试验。眼球采血，血液置于4 ℃冰箱过夜，析出血清。3 000 r/min离心10 min，取上清分装，保存于-80 ℃冰箱。按照试剂盒说明书检测血清中NO、MDA 水平和iNOS、SOD、CAT、MPO、XOD和GSH-Px活性。

1.5 统计分析

采用SPSS 21 windows 进行单因素方差分析，数据用“平均数±标准差”表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PSP-1 对PRV 感染小鼠血清中NO 水平的影响（见图1）

图1 PSP-1对PRV感染小鼠血清中NO水平的影响

如图1所示，与E组相比较，PRV感染后小鼠血清中的NO 水平极显著升高（P＜0.01）。与D 组相比，在经过200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 种不同剂量的PSP-1 处理之后，A、B、C 组小鼠血清中的NO 水平均极显著降低（P＜0.01）。

2.2 PSP-1对PRV感染小鼠血清中iNOS活性的影响（见图2）

图2 PSP-1对PRV感染小鼠血清中iNOS水平的影响

如图2所示，与E组相比，PRV感染后D组小鼠血清中的iNOS水平极显著升高（P＜0.01）。与D组相比较，在经过200、100 mg/kg·BW剂量的PSP-1 处理之后，小鼠血清中的iNOS活性均极显著降低（P＜0.01）。

2.3 PSP-1对PRV感染小鼠血清中MDA水平的影响（见图3）

如图3所示，与E组相比较，PRV感染后小鼠血清中的MDA 水平极显著升高（P＜0.01）。与D 组相比较，在经过200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 种不同剂量的PSP-1 处理之后，小鼠血清中的MDA 水平均极显著降低（P＜0.01）。

图3 PSP-1对PRV感染小鼠血清中MDA水平的影响

2.4 PSP-1对PRV 感染小鼠血清中SOD 活性的影响（见图4）

图4 PSP-1对PRV感染小鼠血清中SOD活性的影响

如图4所示，与E组相比较，PRV感染后小鼠血清中SOD活性显著降低（P＜0.05）。与D组相比较，在经过200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 种不同剂量的PSP-1处理之后，小鼠血清中的SOD活性均极显著升高（P＜0.01）。

2.5 PSP-1对PRV 感染小鼠血清中CAT 活性的影响（见图5）

图5 PSP-1对PRV感染小鼠血清中CAT活性的影响

如图5所示，与E组相比较，PRV感染后小鼠血清中CAT活性极显著降低（P＜0.01）。与D 组相比较，在经过200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 种不同剂量的PSP-1 处理之后，A、B 组小鼠血清中的CAT 活性均极显著升高（P＜0.01），C组的血清CAT 活性显著升高（P＜0.05）。

2.6 PSP-1对PRV感染小鼠血清中MPO活性的影响（见图6）

图6 PSP-1对PRV感染小鼠血清中MPO活性的影响

如图6所示，与E组相比较，PRV感染后小鼠血清中MPO活性极显著升高（P＜0.01）。与D组相比较，在经过200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 种不同剂量的PSP-1处理之后，小鼠血清中的MPO活性均极显著降低（P＜0.01）。

2.7 PSP-1对PRV感染小鼠血清中XOD活性的影响（见图7）

如图7所示，与E组相比较，PRV感染后小鼠血清中XOD 活性极显著升高（P＜0.01）。与D组相比较，在经过200、100 mg/kg·BW和50 mg/kg·BW 3种不同剂量的PSP-1处理之后，A、B组小鼠血清中的XOD活性均极显著降低（P＜0.01）。

图7 PSP-1对PRV感染小鼠血清中XOD活性的影响

2.8 PSP-1 对PRV 感染小鼠血清中GSH-Px 活性的影响（见图8）

图8 PSP-1对PRV感染小鼠血清中GSH-Px活性的影响

如图8所示，与E组相比较，PRV感染后小鼠血清中GSH-Px 活性极显著降低（P＜0.01）。与D 组相比较，在经过200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 种不同剂量的PSP-1 处理之后，A、B 组小鼠血清中的GSH-Px 活性均极显著升高（P＜0.01），C 组的血清GSH-Px活性显著升高（P＜0.05）。

3 讨论

氧化应激是指体内活性氧自由基的生成和细胞抗氧化防御体系之间失衡。当机体内发生氧化应激反应时就会激活多种抗氧化因子和抗氧化酶，其中就包括NO、iNOS、MDA 的分泌水平改变和SOD、CAT、MPO、XOD 和GSH-Px 的活性改变[21-22]。已经有研究论证了以上因子可以被筛选为测试指标[23-24]，如Jiang等[25]利用H9c2细胞的氧化应激模型，通过MDA、SOD、CAT和GSH等氧化指标观察到Nrf2/HO-1信号通路可以被血液中功能性可乐多糖激活，调节和控制，以保护被氧化应激损伤的H9c2细胞。同时多糖的抗氧化应激作用可引起氧化应激指标的改变也在众多研究中得以论证，如Lalsm等[26]发现八角根部的乙醇提取物具有体外抗氧化活性，能够通过调节炎症和氧化应激对小鼠急性肾损伤具有保护作用。王爽等[27]为研究石斛多糖的体内体外抗氧化活性，以SOD、GSH-Px和MDA作为观察指标，证明石斛多糖具有清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的作用，可显著提高小鼠血清和肝组织中SOD、GSH-Px活力，降低MDA含量。崔香丹等[28]用分光光度法检测细胞内MDA水平、SOD活力和GSH水平，证明草苁蓉多糖对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡具有抑制作用。明确了多糖具有抗氧化的生物活性之后，纵向深入探究螺旋藻多糖的抗氧化生物活性。李羚等[29]在其研究中利用Fenton反应、光照核黄素产生活性自由基，以分光光度法研究了螺旋藻及螺旋藻多糖体外清除活性氧及抗氧化作用研究，结果表明了螺旋藻多糖能够抑制氧化损伤。这个理论也为试验提供了有利的理论支撑。前人对于病毒感染之后利用中药的抗氧化作用来缓解机体的氧化应激的研究也很多，如曹迷霞等[30]在利用西番莲多糖提取物对猪圆环病毒2型感染RAW264.7细胞氧化应激的研究中就从细胞层面阐明了多糖对于病毒感染所致的氧化应激具有缓解作用。

有氧代谢或外援性氧化剂能够使正常细胞在呼吸作用的过程中产生有毒的活性氧（ROS），包括超氧化物和过氧化氢（H2O2）。经证明超氧化物（·O2-）和NO的作用是杀死吞噬细胞中的入侵微生物。在细胞中，NO 是由L-精氨酸（L-Arg）和O2通过iNOS 合成的。胞浆中L-Arg的消耗会触发iNOS产生·O2-，并有助于细胞抑制细胞毒性作用[31]。为了探究其抗氧化机理，首先需要知道在4 种已知的一氧化氮合酶（NOS）亚 型 中，神 经 元NOS（nNOS）、内 皮NOS（eNOS）、组成型表达NOS（cNOS）和iNOS，其中cNOS的生成取决于通过瓜氨酸-NO 循环从L-瓜氨酸循环产生的L-Arg的间隔池[32]。在此循环中存在一种限速酶严格控制cNOS 活性产生的NO[33]，但由于胞质LArg 浓度没有限制，所以iNOS 可以较高水平的产生NO，所以便存在一个问题，高水平的NO 可能对生物有害，使处于氧化前状态的细胞利用NO 产生反应性物质[34]。在这种情况下，会分解L-Arg 的精氨酸酶被激活，以减少iNOS产生的有害NO，干扰有益的NO生成，因为它也与cNOS竞争该底物[35]。L-Arg利用率低会间接导致肺上皮和内皮的进一步氧化和细胞损伤[36]，因此细胞在感染病毒之后NO和iNOS的活性会有上升趋势，在使用药物后会随即下降。MDA 是评价氧化应激损伤的一个重要指标，可以与生物大分子（如蛋白质和核酸）发生反应，以改变其细胞膜的流动性和渗透性，最后改变细胞的结构和功能[37]。SOD已经被证实可以使超氧化物被歧化为H2O2和O2，然后通过CAT和GSH-Px消除H2O2和O2中的氧气，以此达到抗氧化应激的作用，并且对增强吞噬细胞的吞噬能力和整个机体的免疫功能起重要作用[38-40]。MPO可以催化反应性氧化物和自由基形成，激活NADPH氧化酶，产生超氧自由基，引起脂质过氧化反应，从而参与机体的抗氧化应激过程[41]。XOD是细胞产生超氧化物的主要来源之一，XOD可以和黄嘌呤脱氢酶结合成一种复合酶，从而催化黄嘌呤氧化为黄嘌呤，随后产生尿酸，进而诱导活性氧的产生，以此参与抗氧化应激反应[42]。

本试验结果显示血清中NO、iNOS的水平和MPO、XOD、MDA的活性下降极显著；CAT、GSH-Px、SOD的活性增加极显著，与前人的研究结果一致，表明螺旋藻多糖具有抗氧化活性，其作用机理是对小鼠非特异性免疫及体液免疫中抗体形成环节具有一定的促进和调节作用，通过调节免疫功能从而达到抗氧化应激的作用[43-44]。综上所述，本试验通过探究氧化应激相关因子（NO、iNOS、MDA、SOD、CAT、MPO、XOD、GSH-Px）水平和活性来研究PSP-1 对PRV 感染小鼠血清中氧化应激相关因子的调节作用，为中药多糖在临床中的应用提供参考依据。

4 结论

小鼠在感染PRV 之后使用不同剂量的药物能够使血清中NO、iNOS的水平和MPO、XOD、MDA的活性下降；使CAT、GSH-Px、SOD 的活性增加。其结果说明PSP-1 对PRV 感染小鼠血清中氧化应激相关因子具有一定程度的调节作用。