凋落物真菌Berkleasmium sp.及其螺二萘类化合物抗菌活性的研究

甄锦程，穆玉婷，司 璐，于洪佳，都婷婷，单体江，徐利剑

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2华南农业大学林学与风景园林学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广州 510642）

0 引言

真菌是重要的生物资源，目前报道的真菌已经超过了15万种，它们可以产生丰富的次生代谢产物，其中一些次生代谢产物可以开发成为药物，应用在医药与农药领域中，日益引起人们的重视，并显示出广阔的前景[1-2]。例如，抗生素青霉素、头孢菌素、灰黄霉素，免疫抑制剂环孢菌素，以及农药甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂最初的活性成分，都与真菌的代谢产物有关[3-7]。在森林凋落物中，尚有大量可培养的、具有抗菌活性的真菌资源，可以为进一步开发和利用凋落物真菌资源提供备选菌株。

真菌是森林系统中的重要分解者，森林凋落物也是真菌的良好栖息地，目前，研究证明森林凋落物与土壤中有大量的真菌资源，其中不乏真菌新物种[8]。在对大兴安岭及长白山森林凋落物的研究中，也相继报道了多个真菌新物种，例如白色粘丝裸囊菌(Myxotrichum albicans)、长 白 黄 微 孢 菌(Parametarhizium changbaiense)和兴安黄微孢菌(P.hingganense)[9-10]。在森林凋落物真菌活性方面，刘博洋等[11]分离培养了40株凋落物真菌，它们隶属于35个属38个分类单元，其中6株真菌为疑似真菌新种，来自2株真菌的2个提取物展现了抗细菌活性，尤其是Parapyenchaeta sp.LB0026菌株具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性。李泽宇等[12]利用颗粒法在大兴安岭冻土中得到66株可培养真菌，有8株为疑似真菌新物种，其中6株新型真菌的提取物具有抗菌活性。张哲栋等[13]分离得到88株森林凋落物真菌，其隶属于57个属74个分类单元，其中6株疑似真菌新种的提取物具有抗菌活性，在2株真菌中得到4个单体化合物，其中2个化合物为首次在真菌提取物中分离。邱天艺[14]分离得到70株大兴安岭森林凋落物真菌，隶属于57个分类单元，21株真菌ITS相似性≤98.5%，其中17株真菌的乙酸乙酯提取物具有抗菌活性，经代谢物分离得到4个单体化合物。

森林凋落物中含有大量未被开发利用的真菌资源，而且这些真菌具有抗菌活性，研究它们产生的代谢物，可以为森林凋落物真菌资源的利用提供备选菌株。本研究以大兴安岭森林凋落物为研究材料，尝试分离其中可培养真菌，测试它们的抗植物病原菌活性，从63株真菌中选取未被深入研究的目标菌株SGSF622(Berkleasmium sp.)，对其进行系统发育学分析与鉴定，并分离得到其主要抗菌化合物，以期为进一步利用森林凋落物真菌产生的天然产物资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 样品采集 森林凋落物样品采集于黑龙江省大兴安岭地区加格达奇区南瓮河国家级自然保护区，该地区为寒温带大陆性气候且受人类活动影响较小，优势树种为兴安落叶松(Larix gmelinii)、蒙古栎(Quercus mongolica)和水曲柳(Fraxinus mandshurica)等。将凋落物装入灭过菌的信封中，于阴凉处自然风干后保存。

1.1.2 培养基及配方 凋落物真菌培养及形态学观察所需培养基选用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)；凋落物真菌发酵所需培养基选用马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)、大米固体培养基(Rice)、酵母浸提物蔗糖培养基(YES)和PDA；凋落物真菌发酵提取物抗细菌活性筛选选用LB固体培养基(LBA)，抗真菌活性筛选选用PDA。上述培养基配方参考李泽宇等[12]的研究。

1.1.3 供试植物病原菌 供试真菌为串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，供试细菌为青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。

1.2 实验方法

1.2.1 凋落物真菌的分离 真菌分离方法采用颗粒平板稀释法，取1 g凋落物粉碎后置于离心管中，加入适量无菌水，充分悬浮，用移液枪将悬浮液加入到1/4PDA培养基平板上，用三角棒均匀涂抹，室温下培养，待菌落长出后用接菌针挑取至新的PDA平板上，进行纯化培养。

1.2.2 凋落物真菌的鉴定 观察真菌的菌落、菌丝及孢子结构形态，根据《真菌鉴定手册》等相关文献书籍和资料，进行形态学鉴定[15]。

分子生物学鉴定。首先利用CTAB法对真菌基因组DNA进行提取[16]。然后，对真菌的内部转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列进行扩增，引物分别为ITS1和ITS4[17]。将所得PCR产物，利用相同引物进行测序，最后利用NCBI网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行比对分析。遗传系统进化树利用Mega 7.0软件[18]获得。对真菌DNA序列进行分析，首先利用ClustalW进行序列比对，然后进行最优进化模型筛选(Find Best DNA Models)，再基于最优模型，利用最大似然法(maximum likelihood，ML)[19]进行系统进化树构建。

1.2.3 菌株发酵及提取物的制备 真菌发酵分别采用PD、Rice、YES和PDA 4种培养基进行发酵。液体发酵，置于25℃、180 r/min黑暗条件下的摇床中培养14天；固体发酵，放入25℃培养箱黑暗静置培养14天。发酵结束后加入等体积乙酸乙酯充分摇匀，静止1天后过滤除掉固体，用分液漏斗取上层有机相，再进行减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物，溶解于1 mL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制成待测样品，每株菌得到4种发酵方式的乙酸乙酯提取物，待抗菌活性筛选用。

1.2.4 抗菌活性测定 采用平板打孔药剂扩散法测定提取物的抗菌活性[20]。

抗真菌活性测定。在PDA平板四周上均匀打6 mm孔，依次加入同一株菌的不同发酵方式的10 μL提取物溶液，然后将测试真菌菌饼接入到培养基中心，放在25℃培养箱内黑暗培养3～7天。

抗细菌活性测定。用移液枪吸取15 mL待测细菌菌液，加入到250 mL融化的LB固体培养基中，摇匀后倒成平板。同上文方法，在平板上均匀打孔，孔中加入提取物溶液，25℃培养箱内黑暗培养1天。选用两性霉素与金霉素作为阳性对照，测量抑菌圈直径，以上实验均重复3次。

1.2.5 抗菌化合物的追踪分离与鉴定 对目标菌株进行发酵，提取3次后，得到其乙酸乙酯提取物。将提取物溶液与3 g的100～200目硅胶样品混合均匀干燥，干法上样至200～300目硅胶柱上。利用甲醇与二氯甲烷溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1 L，得到30个组分标记为S1～S30。进行抗菌活性测定，将活性组分利用葡聚糖凝胶Sephadex LH20进行柱层析，洗脱剂为等量的甲醇与二氯甲烷溶液，进行等度洗脱，流速约为5 s一滴，利用薄层层析(TLC)合并相似组分[21]。采用半制备液相、C18反向硅胶柱、甲醇-水系统进行梯度洗脱，利用紫外检测器进行检测，获得单体化合物。将单体化合物进行核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)分析，通过查阅文献进行化合物的结构鉴定。

1.2.6 单体化合物最低抑菌浓度的测定 参照张哲栋等[13]的方法。单体化合物鉴定后使用96孔(12×8)平板测定其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，用DMSO溶液将单体化合物及阳性对照金霉素溶解为浓度2000 μg/mL的溶液。在250 mL的三角瓶中放入50 mL的LB液体培养基和2 mL的测试细菌菌液充分混匀，每一个孔都加入100 μL的菌液，后吸取配制好的单体化合物溶液在第1列中加入100 μL，用移液枪将其与混匀后，再吸取100 μL到第2列，依次加到第11列。弃去在第11列吸取的100 μL混合液，并在第12列以DMSO溶液作为阴性对照。每个化合物进行3次重复。密封后放到25℃的培养箱中黑暗培养，24 h后观察结果。

2 结果与分析

2.1 凋落物真菌的分离与鉴定

来自大兴安岭的森林凋落物中共分离到63株真菌，经过ITS序列对比分析可以发现，以上真菌来自于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)3个门、8个纲、12个目、22个科、36个属、48个分类单元。分离菌株ITS序列在与已知真菌的对比中，相似性98.5%以下的有14株（表1），针对这14株真菌进行进一步的抗菌活性研究。

表1 凋落物真菌ITS序列相似性分析

2.2 疑似新种抗菌活性测定结果

针对ITS相似性98.5%以下的14株真菌进行抗植物病原菌活性的研究，其中11株表现出了抗菌活性，结果见表2。其中，6株具有抗真菌活性，菌株SGSF622抗真菌活性最强；10株具有抗青枯劳尔氏菌的活性，其中菌株SGSF622也显示出最强的抗细菌活性。根据表1可知，其最相近菌为Berkleasmium属真菌。

表2 提取物抗菌活性

2.3 SGSF622号菌株的特征

菌株SGSF622号菌株在PDA培养基上25℃培养21天，菌落直径达到23 mm（图1），菌落呈圆形，灰褐色，有放射状沟纹；菌落背面，灰褐色，边缘为白色；气生菌丝呈天鹅绒状，具有分枝，有隔，未见明显孢子。菌株SGSF622的最相近菌为Berkleasmium属真菌，相似性为91%。将与SGSF622相近的Berkleasmium属真菌的已知物种与SGSF622的ITS序列进行系统进化分析（图2），结果显示SGSF622号菌株与Berkleasmium属真菌的B.nigroapicale、B.micronesicum、B.ariense形成一个高支持度的独立分枝，且与B.ariense的2株菌最近，位于它们的基部，由此推测SGSF622可能为Berkleasmium属的新物种，具有进一步研究价值。

图1 SGSF622在PDA培养基上菌落形态学

图2 SGSF622号菌株系统发育分析

2.4 SGSF622号菌提取物化合物的分离鉴定

对菌株SGSF622号菌进行了PDA固体培养基的发酵，获得3 g乙酸乙酯提取物。利用青枯劳尔氏菌进行抗菌活性追踪，得到单体化合物622A、622B、622C，其中化合物622A含量最高。化合物622A为白色粉末状固体，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂。该化合物的13C-NMR(101 MHz，CDCl3)共有20个峰，它们的化学位移值为δ 149.60、147.10、147.06、134.17、131.46、129.66、127.75、127.50、122.86、121.82、121.17、121.13、120.11、112.80、110.01、109.18、97.50、61.89、52.64、50.59。高分辨质谱的分子离子峰m/z为369.0521[M+H]+，分子式为C20H13ClO5，经文献查询比对，将该化合物鉴定为螺二萘类化合物Sch53825[22]，其结构如图3所示。此外还分离了622B和622C 2个化合物，它们的碳谱与622A相似，也为螺二萘类化合物，具体结构尚未确定。

图3 单体化合物622A的化学结构

对已经确定结构的单体化合物622A，利用青枯劳尔氏菌进行了最低抑菌浓度的测定，当化合物622A浓度高于125 μg/mL时无测试菌生长，化合物622A对青枯劳尔氏菌的MIC值为125～250 μg/mL。

3 结论与讨论

本研究对来自大兴安岭的森林凋落物的真菌进行了抗菌活性的研究，共分离得到63株真菌，它们隶属为36个属48个分类单元，它们中有14株菌ITS相似性小于98.5%，可见森林凋落物中真菌多样性较为丰富，其中不乏未被开发利用的真菌。通过抗菌活性测试发现6株真菌提取物具有抗真菌活性、10株具有抗细菌活性，其中SGSF622号菌展现了广谱的抗菌活性。经鉴定SGSF622号菌为Berkleasmium属真菌，Berkleasmium属建立于1958年，SGSF622在ITS序列上与该属已知物种不同，对其进行了系统进化分析与鉴定，SGSF622号菌与Berkleasmium ariense最近[23]，但不相同，推测SGSF622可能为一新物种。Berkleasmium属真菌曾被报道过具有抗真菌、抗细菌及抗肿瘤活性，2009年Cai等[24]报道从内生菌Berkleasmiumsp.Dzf12发酵液中分离得的螺二萘类化合物Diepoxin η和Diepoxin ζ的混合物以及Diepoxin κ对大肠杆菌(Escherichia coli)、根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、番 茄 疮 痂 病 菌(Xanthomonas vesicatoria)、黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等有较好的抑制活性，Diepoxin ζ对稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)的半抑制浓度(IC50)和最低抑菌浓度(MIC)分别为96.21和200 μg/mL[25]。2014年Shan等[26]的研究结果表明，螺二萘类化合物Diepoxin δ和Palmarumycin C8具有较好的细胞毒活性，IC50值的范围在1.28～5.83μmol/L，进一步研究结果表明Palmarumycin C8对多种细菌和真菌都具有一定的抑制作用。可见，Berkleasmiumsp.Dzf12与本研究的SGSF622都可以产生螺二萘类化合物。虽然Berkleasmium属真菌曾被报道分离鉴定了多个螺二萘类化合物，但本研究鉴定的622A(Sch53825)未曾报道在该属真菌中分离鉴定，本研究也是首次报道了大兴安岭凋落物真菌可以产生螺二萘类化合物。另外化合物Sch53825最初被分离自1株未被鉴定的真菌，报道了该化合物具有抑制磷脂酶D的活性，但缺乏该真菌的相关描述[22]，未见有关化合物Sch53825的抗菌活性的相关报道。本研究首次发现了螺二萘类化合物Sch53825具有抗植物病原菌的活性。螺二萘类化合物被认为拥有良好的生物活性[27]，具有被开发成农药及医药的潜力。本研究丰富了真菌产螺二萘类化合物及其活性的研究，证明Berkleasmium属的不同真菌具有产生不同螺二萘类化合物的能力。

综上，本研究分离了63株凋落物真菌，对其中一株菌SGSF622进行了系统发育学分析，将其初步鉴定为Berkleasmium sp.，由于现有条件下未观察到它的产孢结构等形态学特征，其分类学地位还有待深入研究。通过对其次生代谢研究，确定了其可以产生螺二萘类化合物Sch53825，但是否可能产生其他螺二萘类化合物或者其他类天然产物，还有待深入研究。