刺五加果多糖ASPF的结构表征及其体外抗肺癌活性研究

2022-08-22 09:37崔雪娇佟潇禹张彦龙曾伟民
中国农学通报 2022年22期
关键词:多糖活性肺癌

崔雪娇,佟潇禹,张彦龙,,曾伟民,

(1黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室,哈尔滨 150080;2黑龙江大学/农业微生物技术教育部工程研究中心,哈尔滨 150500)

0 引言

刺五加(Acanthopanax senticosus)为五加科五加属植物,主要产自黑龙江、吉林、辽宁、河北等地[1]。现代研究表明,刺五加中含有三萜类、苯丙素类、甾体类等多种活性成分[2-5],刺五加多糖是刺五加中的重要组成成分之一,作为一种生物活性大分子,已被证实在抗肿瘤、增强机体免疫力、抗疲劳、抗氧化等方面[6-9]有着重要作用。目前,国内外专家学者主要偏向于对刺五加根、茎、叶中多糖[10-11]的结构及活性进行研究,对刺五加果多糖鲜有报道。刺五加果是一种外表黑色的小果实,果期在8—10月,可以起到调节神经、治疗心血管疾病、淡化色斑等作用[12-14]。除可入药外,刺五加果实在食品、保健品[15]方面也有着广泛的应用前景,是一种保健养生功能出色的药材和食材。刺五加根、茎的多糖已被证实能够抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。初期研究发现刺五加果实部位中含有大量的多糖类成分,但目前关于刺五加果实部位的结构解析与活性研究较少,尚未见关于抗癌活性的报道。本研究期望得到刺五加果中活性较高的均一分子量多糖,并采用GPC、IR、HPLC等方法对其相对分子量、官能团构成、单糖组成等方面进行探究。以高发性恶性肿瘤细胞系人肺癌细胞A549为研究对象,研究目标多糖对肺癌A549细胞的体外作用效果,为刺五加果实体部位的进一步开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2020年10月—2021年1月在黑龙江大学生命科学学院微生物重点实验室进行。

1.2 材料与仪器

刺五加果实(Acanthopanax senticosus),由海林药业公司于2019年提供,产自黑龙江省勃利县。人肺癌A549细胞株购于北纳创联生物技术研究院。D-葡萄糖醛酸(批号6556-12-3,质量分数≥98%)、D-木糖(批号10010-10210,质量分数≥99%)、L-阿拉伯糖(批号5328-37-0,质量分数≥99%)、D-半乳糖醛酸(批号91510-62-2,质量分数≥98%)、L-鼠李糖(批号10030-85-0,质量分数≥98%)、D-甘露糖(批号140571-21164,质量分数≥98.5%)、D-半乳糖(批号59-23-4,质量分数≥98.5%)、无水葡萄糖(批号10056-21790,质量分数≥99%)、色谱乙腈等均购于天津市科密欧公司;透析袋(北京经科宏达公司),截留相对分子量3000;CCK-8试剂盒(海基生物科技有限公司);Caspase-3,8,9活性检测试剂盒(碧云天);DEAE-52阴离子纤维素,Sephadex G-200葡聚糖凝胶购自上海源叶生物化学试剂有限公司;UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(生工生物)。

RE52-AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;电恒温水浴锅,上海精宏实验设备有限公司;高效液相色谱仪,日本岛津;紫外分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;iMark型酶标仪,美国伯乐;傅里叶变换红外吸收光谱仪,赛默飞世尔;电泳仪,北京六一;定量PCR仪,StepOne Plus型(ABI,Foster,CA,USA)。

1.3 试验方法

1.3.1 刺五加果多糖的提取纯化 取干燥的刺五加果实1 kg,粉碎过筛20目,石油醚回流脱脂2次,一次3 h,药渣置于通风橱自然风干。90℃条件下,按料液比1:40浸提2次,一次3 h,过滤后浓缩提取液,加无水乙醇至80%浓度,过夜沉淀,离心后冻干,Sevage法脱蛋白质至考马斯亮蓝检测为阴性,得到粗多糖ASP。称取30 g ASP溶解在蒸馏水中,将其通过2个串联的树脂柱[11],用0.5、1.0、1.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,脱去色素及残留蛋白质,得到ASPA(3.2 g)、ASPB(16.8 g)、ASPC(5.7 g)3组馏分,选择收率最高的ASPB通过DEAE-52柱层析,依次选择0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液洗脱,流速控制1.0 mL/min,得到3组极分,分别命名为ASPB-1、ASPB-2、ASPB-3,经体外抗肺癌筛选试验后,确定ASPB-3为作用最佳馏分,将ASPB-3透析72 h后,通过Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱层析,控制流速15 mL/h,ddH2O洗脱,检测合并相应管数,冻干后得到均一分子量多糖,命名为ASPF。

1.3.2 ASPF的分析鉴定

(1)ASPF的质量分数测定。采用苯酚-硫酸法[16]、Bradford法[17]、硫酸-咔唑法[18]分别检测ASPF中的糖、蛋白质、糖醛酸。

(2)ASPF的相对分子量测定。色谱条件:Tskgel G2500PWXL色谱柱(250 mm×4.6 mm),示差折光检测器RID-20A(+),流动相为超纯水,流速0.8 mL/min,进样量20 μL,柱温40℃。

将样品ASPF用流动相溶解并配制浓度为2mg/mL,测定其纯度。再将不同分子量葡聚糖标准品(12000、25000、50000、270000、410000)按照其相对分子质量从大到小依次进样,绘制标准曲线,得到回归方程,计算样品的相对分子质量Mw值。

(3)ASPF的红外光谱分析。称取3.0 mg ASPF样品,1:100与KBr粉末研磨均匀,压片,在400~4000 cm-1波长下扫描。

(4)ASPF的单糖组成测定。精密称取标准品甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸,用超纯水配制成3 mmol/L的水溶液,制备成混合单糖对照品水溶液,并用同样的处理方法将各单糖配制成为3 mmol/L水溶液。精密称取10 mg ASPF于安瓿瓶中,加3 mL体积2.0 mol/L三氟乙酸(TFA),熔封瓶口后于110℃条件下水解180 min,制得样品水解液,加甲醇反复浓缩至无酸味,2 mL超纯水溶解水解产物,备用。

取各标准单糖、混合单糖水溶液及水解样品溶液1.2 mL于5.0 mL离心管中,分别依次加入600 μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液与0.3mol/L的NaOH溶液,混匀后于75℃水浴中反应30 min,冷却至室温,用600 μL 0.3 mol/L的盐酸溶液中和,依次用等体积的乙酸异戊酯、氯仿溶液萃取2次,离心(5000 r/min,5 min),吸取目标层,0.22 μm微孔滤膜过滤,待用。

色谱条件为:Diamonsil C-18柱(250 mm×4.6 mm),流动相为乙腈-磷酸缓冲盐溶液(17:83),柱温40℃,检测波长245 nm,流速1.0 mL/min,进样量20 μL。

1.3.3 ASPF的抗肺癌活性研究

(1)倒置显微镜观察。培养A549细胞至对数生长期,均匀接种到六孔板中,过夜培养至细胞密度80%。用无菌水溶解3.2 mg样品,2倍稀释至100、200、400、800 μg/mL,样品组为不同浓度ASPF,对照组为空白水溶液,培养48 h后吸尽培养液,PBS漂洗3次,于倒置显微镜下镜检。

(2)CCK-8法检测A549细胞存活率。96孔板设置空白组、对照组和样品组。空白组添加空白培养基,对照组与样品组添加均匀的细胞悬浮液(细胞密度为5×103个/孔),周围边缘孔加PBS溶液。样品孔加入不同浓度的ASPF(25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL),对照孔加入无菌水溶液,培养24、48 h。每孔加入20 μLCCK-8溶液,培养2 h,使用酶标仪在450 nm波长下测定每孔吸光值,并依据式(1)计算肺癌A549细胞存活率。

(3)Caspase酶活性测定。使用Caspase-3,8,9试剂盒对A549细胞裂解液中Caspase酶活性进行测定,对照组为培养基,样品浓度选择200、400 μg/mL。将A549细胞给药处理,培养48 h后用PBS漂洗3次。胰酶消化后,按照说明书要求加入细胞裂解液反应15 min后,测定A549细胞裂解液中Caspase-3,8,9活性。

(4)RT-PCR检测Bcl-2、Bax的mRNA表达量。培养3个平皿细胞至对数生长期,对照组细胞正常培养,剂量组分别给药200、400 μg/mL的ASPF。离心收集细胞,并按每5×107个细胞加入0.5 mL Trizol,遵循试剂盒说明书操作提取细胞RNA。使用Primer Premier 5.0软件设计引物,见表1,逆转录为cDNA后进行PCR,每组反应设置3个复孔,40个循环,以Actin作为内参物。反应完成后,测定Ct值,并采用2-△△Ct法计算。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 ASPF分离纯化结果

由计算得到,经水提醇沉、Sevage法脱蛋白质后得到的粗多糖得率为8.5%。如图1所示,将阴阳离子串联树脂柱洗出的馏分ASPB经Cellulose DE-52阴离子交换柱分离得到ASPB-1、ASPB-2、ASPB-3,3个组分的抗肺癌活性初筛结果如图2,ASPB-3对肺癌细胞的体外抑制效果最佳。ASPB-3的SephadexG-200洗脱曲线如图3所示,合并20~32管得到多糖ASPF。

图1 DEAE-52纤维素离子柱洗脱曲线

图2 DEAE-52柱层析各组分对A549细胞增殖活性的影响

图3 Sephadex G-200凝胶柱洗脱曲线

2.2 ASPF的理化性质

ASPF外表呈白色,外表蓬松,质地轻,易溶于水,不溶于甲醇、丙酮等有机试剂。苯酚-硫酸法检测ASPF的糖含量为89.8%,Bradford法未检测到蛋白质质含量,硫酸-咔唑法检测其糖醛酸含量为22.9%,为一种酸性多糖。

2.3 ASPF的纯度鉴定及Mw值测定结果

采用凝胶渗透色谱法鉴定ASPF纯度发现色谱图中峰形单一且对称,表明该多糖分子量排布均一(图4),紫外图谱在220 nm处有一强吸收峰,为多糖的特征吸收峰,其他位置处(260~280 nm为核酸、蛋白质的特征吸收区)处均无吸收峰,表明已不存在蛋白质、核酸等成分。根据计算得到回归方程(2),将保留时间tR代入得到ASPF的重均相对分子量MW为97462。

图4 ASPF HPGPC色谱图

2.4 IR扫描结果

ASPF的IR扫描图谱(图5)中存在多糖的特征吸收峰。3392.79 cm-1处的强宽峰为羟基的特征吸收峰,2935.66 cm-1处有吸收峰,表明有C-H的伸缩振动,1710 cm-1处有吸收峰为C=O的伸缩振动,1620.21 cm-1处为C=O非对称振动吸收峰,证明ASPF中存在糖醛酸,1417.67 cm-1为糖醇羟基-C-OH的面内弯曲振动峰,1101 cm-1附近的峰值确认了C-O-C的存在,证明ASPF中的糖基为吡喃糖环构型,772.62 cm-1处的典型峰表明其具有α-糖苷的构型。

图5 ASPF的IR扫描图

2.5 ASPF的单糖组成

以单糖标准品与ASPF水解物进行保留时间比对,最终确定ASPF由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖组成(图6~7、表2),物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。

图6 单糖标准品液相色谱图

图7 ASPF单糖组成液相色谱图

表2 标准品、样品中单糖的保留时间

2.6 ASPF作用下人肺癌A549细胞形态学变化

倒置显微镜下可观察到阴性对照组细胞贴壁生长状态良好(图8),主要呈现梭形,紧密排列。阳性对照组姜黄素处理后细胞形态变圆,胞质破碎,出现了严重的空泡化现象。在用100 μg/mL ASPF处理后,细胞外周出现皱缩,200 μg/mL ASPF作用下,细胞之间的连接性消失,在400 μg/mL给药浓度下大部分细胞形态已经变圆,细胞液中有大量死细胞漂浮,到800 μg/mL药物作用浓度时细胞开始出现空泡化现象。

图8 A549细胞凋亡形态变化的倒置显微镜图片(200×)

2.7 ASPF对人肺癌A549细胞的抑制作用

ASPF作用下的人肺癌A549细胞存活率如图9所示。当作用时间为24、48 h时,在25 μg/mL浓度时相比对照组出现显著性差异,200 μg/mL时出现极显著性差异。ASPF对A549细胞抑制效果显著,且随剂量依赖性上升。综上说明ASPF对肺癌A549细胞具有良好的抑制效果。*

图9 不同浓度ASPF对A549细胞存活率的影响

2.8 ASPF对A549细胞Caspase-3,8,9酶活性的影响

细胞凋亡途径主要分为外源性与内源性凋亡途径。在通常情况下,细胞膜表面的死亡受体受到刺激后会促使线粒体释放细胞色素C,并增强Caspase-8的表达,同时与Caspase-9而形成复合体,激活Caspase-3的表达,从而启动激酶级联反应,共同促进细胞凋亡[19]。本研究采用Caspase活力测定试剂盒检测了在ASPF的作用下,Caspase-3,8,9活力的变化(图10),发现对照组细胞基本无变化,因此以对照组为参比,计算剂量组中Caspase酶的活力变化。结果发现,在ASPF处理组中,Caspase酶活力均有不同程度的上升,与对照组相比存在显著性差异,其中以Caspase-3,8酶活力增强最为明显,且随剂量依赖式增长。

图10 ASPF对A549细胞Caspase酶活性的影响

2.9 ASPF对Bax、Bcl-2的mRNA表达量影响

同一家族的Bcl-2与Bax是2种重要的凋亡因子,能够通过改变线粒体内膜通透性而控制凋亡激活物产生。RNA的电泳结果如图11所示,在ASPF处理48 h后,促凋亡基因Bax的mRNA表达量显著上调,而抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达量显著下降(图12)。因此,ASPF可能通过增强Bax的mRNA表达并下调Bcl-2表达而促进细胞色素c的释放,激活Caspase-9而产生凋亡小体,从而激活Caspase-3,最终达到促进癌细胞凋亡的效果。

图11 RNA电泳检测图

图12 ASPF对Bcl-2/Bax的mRNA表达量影响

3 结论与讨论

结构解析一直是多糖研究中的难点,由于多糖的相对分子量大且纯化难度较高,会给其结构研究带来较大干扰。目前对刺五加根茎中分离得到的多糖结构研究较多,其单糖组成主要为甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖等常见单糖。本试验从刺五加果中纯化得到的多糖ASPF,分子量为97462,主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖组成,物质的量之比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62,IR光谱推测ASPF中的糖基主要为吡喃构型。比较特别的是在ASPF中,半乳糖醛酸的含量较高,通过糖醛酸含量的测定结果显示其中糖醛酸含量高达22.9%,显著高于根茎中多糖中糖醛酸的含量,与Xia等[11]从刺五加叶中分离出的ASP-B2、ASP-B3结构较为相似。

肺癌是发病最快、死亡率最高的肿瘤疾病之一。化学治疗、放射治疗与手术治疗方法是肺癌晚期重要的治疗手段,但副作用极大。研究表明,灵芝多糖、黄芪多糖等中药多糖对肺癌细胞增殖有着显著抑制作用,对防止癌症扩散有着重要意义[20-21]。Zhao等[22]报道了从刺五加茎干部位提取得到的多糖ASPS对人肺癌H446细胞增殖有抑制作用,可以通过提高ERK与P38的活化阻滞细胞周期,进而达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。本研究首次报道了刺五加果多糖的抗肺癌活性,当ASPF作用时间为48 h时,IC50值为424.39 μg/mL,对肺癌549细胞显示出了较高的抑制作用,明显高于纯化前的抑制效果。

细胞凋亡是由一系列基因调控,为了适应环境而主动死亡的过程,与死亡有本质性区别,在胚胎发育、神经系统调节、疾病发展等方面有着重要作用。细胞凋亡通常是由各种凋亡基因如Bcl-2家族、Caspase家族、P53等调控,在凋亡的同时细胞形态发生较大变化,如细胞膜破碎、核仁裂解等[23-25]。本研究选择Caspase-3,8,9酶的活力变化作为研究对象,结果显示这3种Caspase酶活力均有明显上升,出现了显著性差异,其中以Caspase-3的活力变化最明显,Caspase-8的激活能够活化全部凋亡通路的下游Caspase成员,说明ASPF能够通过促进Caspase-8,9的活化而增强Caspase-3的表达。同时,采用RT-PCR法检测Bcl-2/Bax的mRNA表达发现,不同浓度的ASPF可以从mRNA水平降低Bcl-2/Bax的表达值,为ASPF诱导细胞凋亡提供了有力的依据。肿瘤细胞凋亡除与其自身凋亡通路有关外,也有多项研究证明中药多糖可通过增强机体自身的免疫调节能力。中药多糖可以通过促进免疫细胞增殖,增强巨噬细胞以及NK细胞和T、B淋巴细胞的活化来达到增强免疫调节能力的作用[26],因此,未来也可以从ASPF的机体免疫调节能力出发研究其促进A549细胞凋亡机制。

综上,本研究对刺五加果中提取得到的粗多糖ASP进行纯化,采用活性初筛的方法,对活性最高的馏分进行纯化,最终得到了抑制效果最佳的多糖命名为ASPF,并结合GPC、IR、HPLC等方法分析了ASPF的结构表征。且首次发现刺五加果多糖对人肺癌A549细胞具有较强的体外抑制作用,当ASPF作用48 h时,其IC50值为424.39 μg/mL,相比较纯化前的664.6 μg/mL,其抑制效果有着显著性增强。ASPF能够在mRNA表达量上降低Bcl-2/Bax的比值而达到促进细胞凋亡的效果。

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