阳原驴MSTN基因生物信息学分析及组织表达研究

付永智，马晓君，王茂晗，李 哲，陈芝媛，权 伟，赵 涵，苏咏梅，吴建华，朱文进

(河北科技师范学院动物科技学院，秦皇岛 066004)

肌生长抑制素(myostatin,MSTN)又称GDF-8，属于转化生长因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族，是对动物骨骼肌生长起负调控作用的基因之一，由3个外显子和2个内含子组成，且CDS序列在不同物种中高度保守[1]。MSTN基因的作用机制是通过抑制细胞周期进展和终端肌细胞增殖，从而抑制肌肉的生长，其突变是肌肉肥大、增生的重要条件[2-3]。研究发现，MSTN基因多态性与猪、牛、羊和家禽的生长性状均呈显著相关[4-9]。MSTN基因突变可能对其编码蛋白的功能及表达水平造成影响。McPherron等[10]研究发现，皮埃蒙特牛MSTN基因第3外显子中的1个错义突变使蛋白质成熟区中的半胱氨酸被酪氨酸取代，蛋白质功能发生改变，导致肌肉肥大。Mosher等[11]研究发现，惠比特犬MSTN基因第3外显子中2 bp的缺失导致蛋白翻译过程提前终止，相比正常表达水平减少20%。MSTN基因的表达水平能够影响动物的肌肉质量，表达量降低会造成骨骼肌增生、肥大，形成双肌现象，过表达则会减少肌肉重量[12]，因此，MSTN基因是动物肌肉生长过程中的重要影响因子。目前，有关家驴MSTN基因的研究只有Liu等[13]报道的在中国13个家驴品种中检测到4个SNPs位点(g.65 T→C、g.872 A→G、g.2017 G→A和g.2395 C→G)，而对家驴MSTN基因生物信息学分析和组织表达的研究鲜见报道。阳原驴是河北省优良地方品种，其突出优点是净肉率高[14]。本研究以阳原驴为研究对象，通过PCR技术扩增阳原驴MSTN基因CDS序列，并对其编码的蛋白序列进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR技术检测MSTN基因在不同月龄阳原驴肌肉组织和18月龄不同组织中的表达水平，以期为MSTN基因在阳原驴肌肉生长发育方面的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集 选择6、12、18、24月龄的健康阳原母驴各3头，采集颈静脉血样，-20 ℃保存备用。屠宰后，采集背最长肌、腿肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的组织样本，用无RNA酶的冻存管装好后放入液氮冷冻，带回实验室后-80 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 动物总RNA快速提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit、BlazeTaqSYBR Green qPCR Mix 2.0均购自广州复能基因有限公司；2×ExTaqMasterMix(Dye)、DNA MarkerⅠ均购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中公布的马(登录号：NC_009161.3)、牛(登录号：NC_037329.1)和山羊(登录号：NC_030809.1)MSTN基因序列，设计3对引物扩增阳原驴MSTN基因CDS序列，参照马MSTN基因mRNA序列(登录号：XM_008516515.1)设计1对定量引物，内参基因为GAPDH，引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 基因组DNA、总RNA提取及cDNA合成 基因组DNA采用酚-仿法从血样中抽提；总RNA快速提取法参照上海捷瑞生物工程有限公司试剂盒说明书操作。用核酸浓度测试仪检测基因组DNA和总RNA浓度，合格后使用SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为cDNA。-20 ℃保存备用。

表1 引物信息

1.2.3 PCR扩增及测序 PCR扩增体系20 μL：基因组DNA 1.5 μL，上、下游混合引物1.5 μL，2×ExTaqMasterMix(Dye) 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性40 s，退火(退火温度见表1)40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增产物经1.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定合格后送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 序列相似性比对和系统进化树构建 将测序结果用DNAMAN软件拼接，拼接后的序列使用DNAStar软件与马(登录号：XM_008516515.1)、野猪(NM_214435.2)、猕猴(登录号：XM_012647928.1)、人(登录号：NM_005259.3)、牛(登录号：NM_001001525.3)、绵羊(登录号：NM_001009428.3)、山羊(登录号：NM_001285737.1)及骆驼(登录号：XM_006189223 3)的序列进行多重比对。用Mega 7.0软件构建系统进化树。

1.2.5 生物信息学分析 利用生物信息学分析工具对阳原驴MSTN基因编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、结构域及高级结构等进行预测，具体软件信息见表2。

表2 生物信息学分析工具

1.2.6 实时荧光定量PCR 以6、12、18、24月龄阳原驴背最长肌和腿肌组织以及18月龄心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，每个样本设置3个重复。PCR反应体系20 μL：模板cDNA 2 μL，上、下游混合引物4 μL，5×BlazeTaqSYBR Green qPCR Mix 4 μL，ROX Reference Dye(30 μmol/L) 0.1 μL，ddH2O 9.9 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。

1.2.7 数据分析 使用2-△△Ct法计算各个组织中MSTN基因的相对表达量，并用SAS 9.4软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，结果用平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 阳原驴MSTN基因PCR扩增

由图1可知，阳原驴MSTN基因不同引物扩增片段大小分别为600、566和507 bp，且条带专一，均符合预期，可直接进行测序。测序结果显示无重叠和非目的片段。

2.2 不同物种MSTN基因相似性比对及系统进化树构建

对PCR产物测序结果进行拼接发现，阳原驴MSTN基因CDS序列长1 128 bp，编码375个氨基酸，其与马、野猪、骆驼、猕猴、人、绵羊、牛和山羊的核苷酸序列相似性分别为99.9%、97.3%、96.8%、96.3%、95.9%、93.8%、93.7%和93.7%(图2)；氨基酸序列相似性分别为99.7%、98.3%、98.1%、97.8%、97.5%、94.7%、94.7%和94.7%(图3)。系统进化树结果显示，阳原驴与同属的马聚为一类，与山羊和绵羊的亲缘关系最远(图4)。

M，DL600 DNA Marker；1～3，引物S1、S2、S3的PCR扩增产物M,DL600 DNA Marker;1-3，PCR amplification products of S1,S2 and S3 primers，respectively图1 阳原驴MSTN基因PCR扩增电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification of MSTN gene in Yangyuan donkeys

图2 阳原驴与其他物种MSTN基因核苷酸序列的相似性比对Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of MSTN gene between Yangyuan donkeys and other species

2.3 生物信息学分析

2.3.1 理化性质和亲/疏水性分析 阳原驴MSTN蛋白的分子式为C1911H3015N513O562S21，带负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为47个，带正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为48个(表3)。预计半衰期为30 h，脂肪指数为83.95，不稳定指数为42.79，为不稳定蛋白。由图5可知，第14氨基酸处(缬氨酸)疏水性最高，为3.100；第28位氨基酸处(谷氨酸)亲水性最低，为-3.244，亲水性总平均值(GRAVY)为-0.406，属于亲水性蛋白。

图4 MSTN基因系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of MSTN gene

表3 阳原驴MSTN蛋白氨基酸组成

2.3.2 跨膜结构、信号肽和亚细胞单位预测 阳原驴MSTN蛋白不存在跨膜区，存在信号肽区域，序列为：MQKLQIYVYIYLFVLILA，位于序列85-102位氨基酸处，101-102位氨基酸处可能存在切割位点(图6)。亚细胞定位结果显示，MSTN蛋白在细胞核、线粒体、细胞质、细胞膜、膜外、高尔基体、囊泡和内质网中占比分别为39.1%、17.4%、17.4%、8.7%、4.3%、4.3%、4.3%和4.3%。

图5 阳原驴MSTN蛋白的亲/疏水性预测Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

图6 阳原驴MSTN蛋白信号肽预测Fig.6 Signal peptide prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.3.3 糖基化及磷酸化位点预测 糖基化及磷酸化位点预测结果显示，阳原驴MSTN蛋白共有34个磷酸化位点，分别为16个丝氨酸、14个苏氨酸和4个酪氨酸位点(图7)；6个O-糖基化位点分别位于第50、73、114、123、258和264位氨基酸处，1个N-糖基化位点位于第71位氨基酸处(图8)。

图7 阳原驴MSTN蛋白磷酸化位点预测Fig.7 Phosphorylation site prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

图8 阳原驴MSTN蛋白糖基化位点预测Fig.8 Glycosylation site prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.3.4 二级结构及三级结构预测 阳原驴MSTN蛋白的二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链占比分别为21.60%、3.73%、50.93%和23.73%(图9)。阳原驴MSTN蛋白三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成(图10)，与二级结构预测结果一致。

c，无规则卷曲；t，β-转角；h，α-螺旋；e，延伸链c，Random coil；t，Beta turn；h，Alpha helix；e，Extended chain图9 阳原驴MSTN蛋白二级结构预测Fig.9 Secondary structure prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

图10 阳原驴MSTN蛋白三级结构预测Fig.10 Tertiary structure prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.3.5 保守结构域预测 阳原驴MSTN蛋白的保守结构域预测结果显示，第145―747位氨基酸区域为TGF-β前肽，又称潜伏期相关肽，其二硫键与TGF-β蛋白紧密相连。第802―1 125位氨基酸区域属于TGF-β结构域(图11)。

图11 阳原驴MSTN蛋白保守结构域预测Fig.11 Conserved domain prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.4 MSTN基因在不同月龄阳原驴肌肉中及18月龄不同组织中的表达水平

MSTN基因在不同月龄阳原驴背最长肌和腿肌中的表达水平见图12。由图12可知，18月龄阳原驴MSTN基因在背最长肌和腿肌中表达水平显著高于6、12、24月龄(P<0.05)，6和24月龄的表达水平显著低于12月龄(P<0.05)。

相同组织不同月龄间，肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)In the same tissues and different months,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)图12 MSTN基因在不同月龄阳原驴背最长肌和腿肌中的表达水平Fig.12 Expression of MSTN gene in longissimus dorsi muscle and leg muscle of Yangyuan donkeys at different months

鉴于MSTN基因在18月龄阳原驴肌肉组织中表达水平最高，进一步分析MSTN基因在不同组织中的相对表达量，结果见图13。由图13可知，MSTN基因在不同组织中均都有表达，其中在背最长肌中的表达水平显著高于其他组织(P<0.05)；在腿肌中的表达水平显著高于内脏组织(P<0.05)；肺脏、脾脏和肾脏中的表达水平无显著差异(P>0.05)，但均显著高于肝脏和心脏(P<0.05)。不同组织中表达水平依次为背最长肌>腿肌>肺脏>脾脏>肾脏>肝脏>心脏，由此可见MSTN基因主要在肌肉中表达。

肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)图13 MSTN基因在18月龄阳原驴不同组织中的表达水平Fig.13 Expression of MSTN gene in different tissues of 18 months old Yangyuan donkeys

3 讨 论

MSTN基因是调控骨骼肌的主效基因之一，由McPherron等[15]于1997年在小鼠体内发现，目前已在多个物种上被克隆和分析。本研究成功扩增出阳原驴MSTN基因完整CDS序列，长1 128 bp，编码375个氨基酸，与马的相似性最高，达99.9%，符合传统的生物学分类。阳原驴MSTN基因编码蛋白中亮氨酸含量为9.1%，占比最高；组氨酸和色氨酸含量均为1.6%，占比最低。此外，可以维持蛋白活性的甲硫氨酸和半胱氨酸含量分别为2.1%和3.5%，甲硫氨酸和半胱氨酸可以促进二硫键形成，在细胞内同源二聚化，这是MSTN基因翻译后修饰的重要步骤，此后其编码蛋白才具有生物学活性[16-17]。糖基化和磷酸化是蛋白修饰的2种方式，磷酸化修饰会影响蛋白活性，而糖基化修饰在细胞黏附和信号转导等方面具有重要作用[18]。本研究结果显示，阳原驴MSTN蛋白包含6个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和34个磷酸化位点，为其作用机制的进一步研究提供了参考。

阳原驴MSTN蛋白为不稳定的亲水性蛋白。蛋白的亲水性残基位于结构的表面，内部为疏水性的氨基酸，说明MSTN蛋白属于可溶性蛋白。蛋白稳定与否与二级结构中无规则卷曲占比有关，该结构为活性部位，容易受侧链影响。阳原驴MSTN蛋白二级结构和三级结构中无规则卷曲占比最高，与郭勇等[19]分析的江香猪MSTN蛋白二级结构中无规则卷曲占比最高的结果一致，说明蛋白不稳定的特性在种间高度保守。MSTN蛋白不存在跨膜区，有信号肽剪切位点，蛋白可以进行细胞间的信号交流，说明其属于分泌性蛋白；亚细胞结构定位主要在细胞核中，这可能与MSTN基因是以潜在复合体形式分泌的方式有关[16]。保守结构区预测结果显示，MSTN蛋白氨基酸序列第145―747位氨基酸区域为TGF-β的前肽区域，而C-末端的802―1 125位氨基酸区域为成熟区，其在不同物种之间高度保守。

MSTN基因在动物不同生长发育时期的肌肉组织中表达水平不同。毛亮等[20]研究结果显示，MSTN基因在藏鸡腿肌和胸肌中的表达水平最高，其次为心脏；姜懿轩等[21]对新西兰兔MSTN基因组织表达谱研究结果发现，MSTN基因在腿肌中的表达水平最高，其次为肾脏，肝脏最低；梁婧娴等[22]研究表明，MSTN基因在3～12月龄藏系绵羊腿肌中表达呈现先升高后降低的趋势，其中6和12月龄的表达水平最高，与江炎庭等[23]研究MSTN基因在3、6、9、12月龄云上黑山羊腰肌、腿肌和背最长肌中表达水平的结果基本一致。本研究发现，阳原驴MSTN基因在6～24月龄背最长肌和腿肌中也是呈现先升高再降低的趋势，且以18月龄表达水平最高，进一步分析该基因在18月龄不同组织中的表达水平，结果显示，阳原驴MSTN基因在不同组织中均有表达，但以背最长肌和腿肌中的表达水平较高，与以上研究结果基本一致，说明MSTN基因主要在肌肉中表达，而在其他不同组织中的表达水平较低，且不同组织间有一定的差异。

4 结 论

本研究成功扩增出阳原驴MSTN基因CDS区，其在不同物种之间具有高保守性。MSTN基因在18月龄阳原驴背最长肌和腿肌中的表达水平均最高，且在18月龄阳原驴不同组织中仍以背最长肌和腿肌表达水平较高，说明MSTN基因表达水平对阳原驴骨骼肌的生长发育具有重要的调控作用。