猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

刘小兰，刘昌锦，余文洋，李潇翔，边彦超，黄校花，罗 锋，邓舜洲

(1.江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045；2.江西金伊博生物科技有限公司，南昌 330013)

猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)是导致哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的常见病原之一，属呼肠孤病毒科轮状病毒属成员[1]。感染PoRV后，发病猪主要表现厌食、呕吐、水样腹泻等特征，PoRV在世界范围的流行非常普遍，各种年龄、性别的猪均可感染，主要危害1～4周龄仔猪，尤其1～10日龄仔猪感染后发病率可超过80%，死亡率为50%～100%[2-3]，成年猪多为隐性感染，该病潜伏期短、传染性强、流行范围广，给养猪业造成巨大的经济损失。

PoRV为无囊膜正链 RNA 病毒，具有二十面体立体对称的双层衣壳，直径在65～75 nm之间，在电镜下，可观察到形似“车轮状”的病毒粒子[4]。病毒核酸由11个双股RNA基因片段组成，每一基因片段各编码一种蛋白，其中VP1～VP4、VP6、VP7为结构蛋白，NSP1～NSP6为非结构蛋白[5]。VP6是数量最多的结构蛋白，是病毒的群抗原，根据VP6可将轮状病毒分为10个基因群(A～J)，其中A群轮状病毒(RVA)是最典型的轮状病毒。轮状病毒的基因型主要根据病毒表面的VP4和VP7蛋白分型，分别为P、G血清型，目前在人和动物的RVA中发现35个P血清型和27个G血清型[6]。

1969年轮状病毒在犊牛中首次被报道[7]，随后1975年Rodger等[8]在猪粪便中分离到PoRV，中国于1982年由庞其方等[9]在腹泻仔猪粪便中分离出该病毒，随后陆续有学者在马、羊、鸡等多种动物的腹泻粪便中发现轮状病毒。PoRV在全球范围内广泛分布，以猪RVA最为常见，其复杂的流行病学、遗传多样性被广泛研究，在猪群中的患病率在3.3%～67.3%之间，猪场阳性感染率为61%～74%[10-11]，此病毒的感染传播高发季为早春、冬季和晚秋这些温度较低时节[12]。PoRV常与多种猪源性传染病混合感染仔猪，导致PoRV的流行很复杂。本试验从疑似PoRV感染的猪场采集病料，对此病毒的分离培养条件进行探究，利用MA104细胞分离获得1株PoRV，观察该分离株人工感染新生仔猪后的临床表现和剖检病理学变化，以期为PoRV的流行情况提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、细胞系和试验动物 病料为江西南昌某规模化猪场腹泻仔猪的小肠样品，-80 ℃保存备用；MA104细胞(CRL-2378.1)、Vero细胞(CCL-81)、PK15细胞(CCL-33)、MARC-145细胞(CRL-12231)、McCoy细胞(CRL-1696)、ST细胞(CRL-1746)、IEC-18细胞(CRL-1589)、IPEC-J2细胞均由江西农业大学预防兽医室保存；1日龄未吃初乳初生仔猪购自江西省某规模化猪场。

1.1.2 主要试剂 高糖DMEM细胞培养液、胎牛血清(Gibco公司)；反转录酶M-MLV、RRI试剂(TaKaRa公司)；胰酶、羊抗鼠FITC-IgG抗体(Solarbio公司)；鼠抗轮状病毒VP6蛋白高免血清(效价1∶5.12×105至1∶10.24×105)由江西农业大学预防兽医教室制备保存；一步法反转录实时荧光定量检测试剂盒(GenStar公司)。

1.2 病料处理

取小肠组织用无菌匀浆器匀浆后，按比例制成1∶10的DMEM悬液，反复冻融3次，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，用0.22 μm细菌滤器过滤上清液，-80 ℃保存备用。

1.3 引物设计与合成

参考GenBank中收录的轮状病毒VP4基因序列(登录号：KC113250.1)设计1对VP4基因全长的测序引物；参考GenBank上收录的A型轮状病毒的VP7基因序列(登录号：MT025938.1)设计2对引物，分别作为检测引物和VP7基因全长的测序引物；参考CV777毒株的ORF1基因序列(登录号：LT906581.1)设计猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的检测引物；参考HE-1毒株的N基因序列(登录号：KX083668.1)设计猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测引物，引物序列见表1。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 RT-PCR扩增

采用TRIzol法提取病毒总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL：cDNA模板2 μL，HiFi Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，HiFi酶0.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共37个循环；72 ℃延伸8 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5 病毒分离培养

在病毒滤液中加入终浓度为15 μg/mL的胰酶，37 ℃处理1.5 h。取出汇合度约90%的MA104细胞，弃去培养液，并用无血清的DMEM洗3遍，将处理好的样品接种于细胞，37 ℃吸附2 h，加入含终浓度为7.5 μg/mL胰酶的DMEM维持液，继续培养48 h后收集病毒液，反复冻融3次，即为第1代P1分离株，收集培养液进行下一代在MA104细胞上盲传，直至产生细胞病变，同时收集每代的细胞培养物进行RT-PCR扩增鉴定。

1.6 病毒鉴定

1.6.1 病毒VP4、VP7基因RT-PCR鉴定 提取分离毒株的第5(P5)和第10代(P10)细胞培养物的RNA，将其反转录为cDNA，以此为模板，分别用VP4、VP7基因特异性引物进行PCR扩增，扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并将产物送至湖南擎科生物技术有限公司测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，从GenBank中查找到PoRVVP4和VP7各型的参考毒株，利用Mega 7.0软件构建VP4、VP7基因的系统进化树，确定分离株的基因型。

1.6.2 病毒间接免疫荧光试验鉴定 将MA104细胞接种于96孔细胞培养板，细胞长成单层后接种病毒液，37 ℃培养48 h后弃上清，预冷甲醇固定，以鼠抗VP6蛋白多克隆抗体(1∶2 000)为一抗、羊抗鼠FITC-IgG(1∶500)为二抗对病毒进行染色检测，于倒置荧光显微镜下观察检测结果。

1.6.3 病毒电镜观察 收集分离株细胞培养物，病毒液反复冻融3次，12 000 r/min离心10 min，离心上清经蔗糖浓缩后透析，过0.22 μm细菌滤器，收集滤液经磷钨酸负染后用日立HT7700透射电镜观察病毒形态。

1.7 病毒部分生物学特性检测

1.7.1 病毒增殖曲线绘制 取出汇合度约90% MA104细胞，用无血清培养液洗3次，以感染复数(MOI)为0.05的病毒量感染，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h后，弃病毒液，每孔补加含5 μg/mL胰酶的无血清DMEM维持液，每隔4 h刮取细胞，收集病毒液。将各时间点收集的病毒液分别按照10倍倍比稀释，从10-1稀释至10-8，接种于已铺满MA104细胞的96孔细胞培养板，并设正常细胞作为对照，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 d后。利用间接免疫荧光试验进行荧光染色观察，按照Reed-Muench法计算各时间点的50%组织细胞感染量(TCID50)，并以时间为横坐标、各时间点的TCID50为纵坐标，绘制病毒的增殖曲线。

1.7.2 分离毒株对不同细胞的易感性 将MA104、Vero、IPEC-J2、PK15、MARC-145、McCoy、ST、IEC-18细胞分别接种于96孔细胞培养板中培养，待细胞铺满培养板后，用无血清的DMEM培养液洗3次，以MOI为0.05的病毒量感染分离毒株，置于37 ℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，弃病毒液，每孔补加含5 μg/mL胰酶的无血清DMEM维持液，同时设置相应的正常细胞作为对照，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 d后弃培养液，固定，进行间接免疫荧光检测。

1.8 动物回归试验

将4头1日龄未吃初乳的新生仔猪随机分组，其中试验组3头，对照组1头，试验组仔猪经人工口服分离株第20代细胞培养液，1 mL/头(病毒含量106.0TCID50/mL)，对照组仔猪口服等体积DMEM。每隔2 h饲喂仔猪专用猪奶粉，每隔4 h采集粪便拭子，并记录试验仔猪的食欲及精神状况，攻毒后48 h剖杀。参考许梦怡等[13]建立的PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光定量PCR检测方法，应用一步法反转录实时荧光定量检测试剂盒检测粪便排毒情况。上游引物：5′-CGCGGAGCTAAACGTGAAAA-3′；下游引物：5′-TTACTCTCCATAATTGCGTCTATGTTC-3′；探针：5-(ROX)-CCACAACAGAATGAACGTCTGC-AAGAAAAA-(BHQ2)-3′。PCR反应体系20 μL：2×StarScript Ⅱ Probe One-Step qRT-PCR Buffer 10 μL，StarScript Ⅱ Probe One Step Enzyme Mix 2 μL，探针(10 μmol/L) 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，RNA模板 2 μL，DEPC水补至20 μL。PCR反应程序：50 ℃ 15 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。试验结束后，剖检，收集仔猪小肠样品，用4%多聚甲醛固定，用于HE病理切片染色和免疫组织化学检测。

2 结 果

2.1 病料RT-PCR检测

对处理好的病料样品进行RT-PCR，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明PoRV-F/R引物扩增产物电泳后可见约503 bp的扩增条带，与预期大小相符，而使用PEDV和TGEV特异性引物未扩增出特异性条带(图1)，表明该病料样品含PoRV。

M，DL2000 DNA Marker；1、4、7，病料样品；2，PoRV阳性对照；5，PEDV阳性对照；8，TGEV阳性对照；3、6、9，阴性对照M,DL2000 DNA Marker;1,4 and 7,Sick material samples;2,PoRV positive control;5,PEDV positive control;8,TGEV positive control;3,6 and 9,Negative control图1 样品PoRV RT-PCR检测结果Fig.1 RT-PCR detection results of samples for PoRV

2.2 病毒分离

病料滤液经胰酶处理后接种MA104单层细胞，盲传细胞第1～3代无明显变化；第4～5代细胞在48 h脱落细胞增多；传至第6代时，16～24 h时产生明显的细胞病变，具体表现为细胞变圆皱缩，出现拉网现象并逐渐脱落(图2A)，未感染的MA104细胞正常生长(图2B)。继续传代后，分离毒株逐渐适应MA104细胞，将该毒株命名为PoRV AY01株。

A，AY01毒株感染的MA104细胞；B，正常MA104细胞A,MA104 cells infected with AY01 strain;B,Normal MA104 cells图2 分离株感染MA104细胞时的细胞病变(100×)Fig.2 Cytopathic effect of the isolated strain on MA104 cells (100×)

2.3 分离株鉴定结果

2.3.1VP4和VP7基因检测结果 提取分离株的P5和P10代细胞培养液进行RT-PCR，RT-PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳的检测结果见图3、4。结果显示在约2 331和1 035处出现目的条带，分别与预期VP4、VP7基因片段大小相符。

M，DNA Marker Ⅳ，1，阳性对照；2，P5代细胞培养物；3，P10代细胞培养M,DNA Marker Ⅳ; 1,Positive control; 2,P5 generation cell culture; 3,P10 generation cell culure图3 AY01株VP4基因RT-PCR扩增结果Fig.3 RT-PCR amplification result of VP4 gene of AY01 strain

M，DL2000 DNA Marker；1，阳性对照；2，P5代细胞培养物；3，P10代细胞培养物M,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,P5 cell culture;3,P10 cell culure图4 AY01株VP7基因RT-PCR扩增结果Fig.4 RT-PCR amplification result of VP7 gene of the AY01 strain

2.3.2 分离株基因型鉴定及基因进化树分析 对分离株VP4基因测序结果经BLAST在线比对，结果显示，分离株与PoRV的VP4基因相似性达96.65%，确定分离株VP4基因为P[23]型。系统进化树结果显示，AY01株的VP4基因与四川的猪轮状病毒SCYB-C3株(MT198752.1)的亲缘关系最近(图5)。分离株VP7基因测序结果经BLAST在线比对，结果显示，分离株与PoRVVP7基因相似性达97.78%，确定分离株VP7基因为G5型。系统进化树结果显示，AY01株的VP7基因与黑龙江的猪轮状病毒Zjh3-2株(JX498961.1)的亲缘关系最近，同时与中国流行血清型G5型的代表毒株OSU在进化关系上构成一个分支(图6)。因此分离毒株的基因型为G5P[23]型。

图5 AY01株VP4基因核苷酸序列系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of VP4 gene of AY01 strain

图6 AY01株VP7基因核苷酸序列系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of VP7 gene of AY01 strain

2.3.3 间接免疫荧光试验结果 将分离毒株的细胞培养液接种MA104细胞，以鼠抗VP6蛋白多克隆抗体为一抗、羊抗鼠FITC-IgG为二抗进行间接免疫荧光试验，结果显示，感染病毒的孔内细胞胞浆内可见特异性绿色荧光(图7A)，正常MA104细胞孔内未见荧光(图7B)。

A，AY01毒株感染的MA104细胞；B，正常MA104细胞A,MA104 cells infected with AY01 strain;B,Normal MA104 cells图7 PoRV AY01株感染MA104细胞间接免疫荧光试验检测结果(100×)Fig.7 IFA test results of MA104 cells infected with PoRV AY01 strain (100×)

2.3.4 病毒电镜观察结果 PoRV AY01株细胞培养物经超速离心纯化，负染后进行透射电镜观察，电镜下可看到形态呈球形，具有明显的双层衣壳结构，似车轮状的病毒颗粒，直径大小为61～70 nm，平均大小65 nm(图8)。

图8 PoRV AY01株病毒粒子电镜观察 (20 000×)Fig.8 Electron micrograph of virus particle of PoRV AY01 strain (20 000×)

2.4 分离毒株的部分生物学特性检测结果

2.4.1 分离毒株增殖曲线的绘制 由图9可知，分离株AY01在接毒后8～12 h就可达到病毒滴度峰值，随后进入病毒增殖稳定期(图9)。

图9 PoRV AY01株的增殖曲线Fig.9 Proliferation curve of PoRV AY01 strain

2.4.2 分离毒株对不同细胞的易感性 间接免疫荧光试验结果显示，分离毒株对试验所用细胞有感染，可用免疫荧光方法检测PoRV。在可见光下，分离株在MA104、Vero、IPEC-J2、PK15细胞中产生细胞病变，在ST、McCoy、IEC-18细胞中无细胞病变；经免疫荧光检测，分离株在MA104、Vero细胞中可检测到大面积的荧光，其中毒株在MA104细胞的胞浆内可见特异性绿色荧光，在Vero细胞的细胞核中能检测到特异性绿色荧光，在IPEC-J2、PK15细胞中的荧光较少，在ST、McCoy细胞中只有零星的荧光，在MARC-145、IEC-18细胞中无荧光(图10)。综上得出，分离毒株在所用细胞中的易感性排序为MA104>Vero>IPEC-J2>PK15>ST>McCoy>MARC-145>IEC-18细胞，表明PoRV分离株在MA104细胞上的易感性最好。

图10 分离毒株AY01对不同细胞的易感性(100×)Fig.10 Susceptibility of isolated strain AY01 to different cells (100×)

2.5 动物回归试验

2.5.1 临床症状及剖检变化 试验组3头仔猪接种AY01株后，8～24 h时3头猪排软粪，24～48 h时均陆续由黄色软粪转为水样腹泻，具体表现为精神沉郁、嗜睡，饮食量严重下降，排黄色水样稀粪便，并伴有腥臭味，48 h时剖检攻毒组仔猪可见胃内有未消化的凝乳，小肠肠壁变薄、出血，肠内有黄色液体。试验期间，对照组仔猪未出现上述症状。表明分离毒株AY01株攻毒可致使仔猪持续排毒，并产生典型腹泻症状。

2.5.2 PoRV感染后排毒检测 试验期间每4 h收集2组仔猪肛门拭子，利用一步法实时荧光定量PCR方法监测排毒情况，结果显示，在24～48 h时Ct值变化明显，36～44 h降到最低(图11)，此时仔猪临床表现为饮食量下降，精神萎靡，腹泻严重，排黄色水样粪便。

图11 仔猪接种PoRV AY01株后粪便排毒检测Fig.11 Detection of fecal detoxification in piglets inoculated with PoRV AY01 strain

2.5.3 病理组织及免疫组化切片观察 病理组织切片观察结果显示，试验组仔猪小肠绒毛呈弥漫性萎缩、绒毛减少，脱落(图12A)，对照组肠道结构完整，未见坏死脱落(图12C)。免疫组化检测结果显示，试验组仔猪肠绒毛及黏膜层处分散有褐色点状物(图12C)，为PoRV阳性；对照组仔猪肠道均正常(图12D)。

3 讨 论

PoRV在猪群中的感染非常普遍，在中国规模化猪场仔猪腹泻粪便中的阳性率为7.69%～28.76%[14-17]，早期分离的PoRV很难适应细胞，直到1984年Bohl等[18]首次用胰酶处理样品，感染MA104细胞，开启了PoRV的体外分离培养进程，Benureau[19]证实胰酶能结合轮状病毒颗粒，溶解其外壳蛋白，从而增强病毒的感染能力。随着现代生物科技的发展，对PoRV的分离培养技术逐渐成熟，目前的轮状病毒体外培养是否成功主要由细胞种类、胰酶浓度以及粪液中病毒粒子的完整性等因素决定，其中胰酶在轮状病毒增殖时有重要作用，时洪艳等[20]在处理病料时加入20 μg/mL胰酶消化，从MA104细胞上分离到1株PoRV。陈淑红等[21]则使用30 μg/mL胰酶消化处理才从MA104细胞上分离到PoRV毒株。杨娟[22]仅加入0.1 μg/mL胰酶消化处理病料便从Vero细胞上分离到PoRV SWU-1C/2018株。本研究将病料滤液经终浓度15 μg/mL胰酶预处理，在维持液中添加终浓度7.5 μg/mL胰酶为分离培养PoRV的条件，成功分离到1株PoRV，将该毒株命名为PoRV AY01株。AY01株在MA104细胞上盲传至第6代后表现稳定的细胞病变，具体表现为细胞折光性增强、拉网脱落等，这与张贺伟等[23]、黄小波等[24]结果一致。PoRV在体内只感染肠绒毛的上皮细胞，在体外能感染肾或肠道上皮细胞，其中最敏感的是MA104细胞，随后发现用胰酶处理的轮状病毒也能在ST、MARC-145、PK15、Vero等细胞上增殖[25-27]，本试验分离株能够在MA104、Vero、IPEC-J2、PK15、ST、McCoy、MARC-145细胞中增殖，其易感性排序为MA104>Vero>IPEC-J2>PK15>ST>McCoy>MARC-145>IEC-18细胞，进一步验证MA104细胞是分离轮状病毒的最佳选择。

轮状病毒基因型和血清型很多，且在自然界中还存在着人与动物、动物与动物之间的基因片段重组现象[28-30]，RVA的基因型众多，且G型与P型之间会产生不同的组合，不同组合型的RVA毒株的交叉保护性很低[31-32]。目前，RVA中与猪相关的轮状病毒G血清型有12种，P血清型16种，其中在中国流行的PoRV G血清型为G3、G4、G5、G9、G11和G26，通常会与P[5]、P[6]、P[7]、P[13]、P[23]组合的形式流行[33-34]。在本试验中，分离株的VP4基因与P[23]型的PoRV SCYB-C3株亲缘关系最近，相似性为96.65%，VP7基因与G5型的PoRV Zjhzl3-2株和OSU/USA株相似性分别为97.78%和93.8%，据Matthijnssens等[6]提出的“轮状病毒VP4编码区核苷酸序列相似性>90%，即为同一基因型，轮状病毒VP7编码区核苷酸序列相似性>80%，即为同一基因型”的划分方法，确定AY01株属于G5P[23]型PoRV。在众多PoRV G/P组合型中，G5P[7]型PoRV是全球流行最广泛的组合型，占所有PoRV的37.3%[35]，但随着RVA基因片段间重组频繁，近年来在中国陆续报道了G11P[13]、G9P[23]、G9P[7]、G4P[13]、G26P[13]等新型组合的PoRV[36-38]，本试验报道了一种新组合型PoRV AY01株，丰富了国内PoRV的资料，有利于对国内PoRV的监测。

目前，国内关于PoRV分离的报道越来越多，但关于PoRV对猪致病性的相关报道较少。本试验开展PoRV AY01毒株人工感染仔猪的致病性研究，为防止仔猪母源抗体对试验的影响，选择1日龄新生未吃初乳的仔猪为试验对象，仔猪经口感染分离毒株，在攻毒后24～48 h期间，仔猪表现呕吐、腹泻、排黄色水样并伴有腥臭的稀粪的症状，剖检可见各肠段胀气明显，小肠肠壁变薄，肠系膜充血肿胀，小肠绒毛萎缩，肠上皮细胞脱落、坏死。黄小波等[24]使用3日龄仔猪感染PoRV OSU株，在感染10 h后，仔猪开始腹泻，拉黄色水样稀粪，感染42 h后仔猪脱水死亡。Narita等[39]通过对8头口服PoRV的新生仔猪的肠道病变进行研究时，发现感染PoRV的仔猪在接种后18～24 h表现腹泻，肠绒毛脱落、萎缩，特别是空肠和回肠的变性，这与本试验分离株感染仔猪的症状和病理切片观察结果一致。此外，在整个试验过程中，使用实时荧光定量PCR方法对试验组仔猪粪便排毒情况进行检测，发现试验组仔猪均在24～48 h期间Ct值变化明显，36～44 h降到最低，此时仔猪临床表现为腹泻、呕吐、排黄色水样粪便等典型的PoRV症状，表明此时是仔猪粪便排毒的高峰期。因此，初步得出PoRV在进行动物致病性研究时，可结合仔猪临床与实时荧光定量PCR方法，对试验过程进行监测，当发病症状表现明显及Ct值最低时处死仔猪，能最大程度得到病毒含量高的病料样品。

4 结 论

本试验成功分离到1株基因型为G5P[23]型的PoRV，为了解江西地区PoRV的流行变异情况及有效防治PoRV感染提供了参考依据。