DLC1缺失可通过减少肿瘤免疫促进膀胱上皮细胞癌进展

杨博，杨中华，张奇峰，张瀚，韦羽，王胜

（1.桂林市人民医院泌尿外科，广西 桂林 541002；2.桂林市人民医院麻醉科手术室，广西 桂林 541002）

0 引言

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，研究表明美国每年约有84000个新发病例和17,000人死亡[1]。2020年世界卫生组织报告显示全球膀胱癌每年新增约60万病例和21万死亡病例，在新发病率总人数中排名第11位，每年癌症死亡率方面排名第14位[2]。此外调查显示2020年膀胱癌在中国男性新发病例数中排名第七位（66242），占总新发癌症病例的2.7%[3]。膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma, MIBUC）是膀胱癌中发病率最高的一种，虽然近年来新的靶向治疗方法提高了MIBUC患者的生存率，但患者的预后仍不尽如人意，5年生存率仍低于22.07/100000[2]。目前MIBUC发病机制并不明确，因此进一步研究不同分期肿（特别是早期）瘤组织中相关基因或蛋白的变化，有助于进一步明确MIBUC的发病机制可能为早期诊断和治疗提供新的思路。

RHO家族的RAS相关GTP酶（包括CDC42、RAC和RHO）可调节各种细胞增殖、细胞骨架和粘附功能[4-5]，多项研究表明RHO活性在多种晚期肿瘤中增加[6]。尽管RAS-GTP酶在肿瘤中经常因突变而被激活[7-8]，但这种变化在RHO家族GTP酶中却不太常见[9-10]。相反，其激活剂--RHO特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）功能的增加，和/或其失活剂--Rho鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDIs）和RHO特异性GTP酶加速蛋白（GAPs）功能的降低可维持RHO家族GTP酶活性[5,11,12]。研究发现GAPs将活性Rho-GTP的γ磷酸酯水解为非活性Rho-GDP[10]。人类基因组中的69个RHO特异性GEFs中，只有少数几个与肿瘤的发生有关。然而，在64个RHO特异性GAPs中，肝癌删除（Deleted in Liver Cancer, DLC）家族的Rho-GAPs成员在癌症中表达减少[13-14]。这个家族由三个密切相关的基因组成。DLC1（也被称为Rho GTPase-activating protein 7, ARHGAP7），DLC2，和DLC3。它们编码的Rho-GAP活性强烈地水解Rho-GTP, 进而导致RAS相关GTP酶失活[15]。一个或多个DLC基因的下调可能与肝癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌和乳腺癌相关[16-17]。DLC1是最先发现的Rho-GAPs成员，多项临床和实验研究表明其是一个真正的肿瘤抑制基因。DLC1过量表达可显著抑制肿瘤生长[17]，而内源性DLC1的失活与其他基因和/或表观遗传学变化一起，可导致细胞转化和肿瘤形成[18]。然而，DLC1在肿瘤进展和肿瘤免疫学中的潜在功能和机制仍不清楚，且目前DLC1在MIBUC中的表达及临床意义尚未见报道。因此进一步探究DLC1在MIBUC的发病机制，可能为今后临床诊断及治疗提供新思路。

在这项研究中，我们旨在利用TCGA RNA测序数据，并结合生物信息学和统计方法，包括差异表达基因(DEG)分析、基因本体(GO)术语分析、KEGG通路或疾病分析、基因集富集分析（GSEA），以及Logistic & Cox回归分析系统地分析DLC1在MIBUC中的重要性。

1 方法和材料

1.1 数据来源与处理

NCBI网 站Gene Expression Omnibus （GEO）数据库下载数据集GSE52519相关资料，其中包含3例正常膀胱组织及9例膀胱癌组织的RNA测序数据。使用R语言impute和limma包分别进行标准化处理及基因差异性分析。

基因表达数据与临床信息来自TCGA-BLCA项目（癌旁19，膀胱上皮癌414例，数据库：The Cancer Genome Atlas（TCGA），平台：RNASeq，格式：TPM）。通过R语言limma包提取MIBUC表达数据。

1.2 差异行基因分析

GSE52519 RNA数据进行差异性分析后，选取调整后P值（adjusted P value）＜0.05及 Log2 fold change (Log2FC)＞1.5的基因定义为差异性基因。利用ggplot2和ComplexHeatmap包进行火山图和热图分析。

1.3 DLC1在TCGA-BLCA项目中的表达

非配对样本使用R语言ggplot2进行正态性分布检验及Mann-Whitney U检验(Wilcoxon rank sum test)，并绘制DLC1表达箱图。配对样本使用ggplot2进行正态性分布检验后，选择配对样本T检验进行统计分析，并绘制DLC1配对表达差异图。

1.4 免疫细胞浸润的功能富集和分析

GSEA从DLC1差异表达矩阵入手并分析DLC1高表达组和低表达组之间信号通路的差异，以预测与DSEA相关的表型和信号通路。调整后的P＜0.05和FDR＜0.25被确定为显著的相关通路。使用R软件包clusterProfiler（3.8.0）进行统计分析和绘图。

通过ssGSEA对24种免疫细胞的相对肿瘤浸润水平进行量化，检测各种免疫细胞标志性基因的表达水平[19]。为了进一步探讨DLC1与免疫细胞浸润水平之间的相关性，以及免疫细胞浸润与DLC1不同表达组之间的关系，我们采用了Wilcoxon秩和检验和Spearman相关性分析。

1.5 临床病理特征相关性分析

所有的统计分析都在R包（V3.6.2）中进行。临床病理特征和DLC1之间的关系用Wilcoxon符号秩和检验和逻辑回归进行分析。多变量Cox分析比较了DLC1表达对生存的影响，以及其他临床特征（分期、淋巴结状态、远处转移状态、年龄等）。DLC1表达的临界值是是由其中位数决定的。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

1.6 MIBUC中DLC1低表达组和高表达组差异性基因分析

使用DESeq2（1.26.0版本）对DLC1低表达组（0-50 %）和高表达组（50%-100%）进行差异性基因分析。调整后的基因P值小于0.05且绝对FC值大于1.5的基因被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLC1在MIBUC中低表达

为探索膀胱尿路上皮癌的潜在机制，我们使用已发表的数据集（GSE52519）分析3例正常膀胱组织和9例膀胱癌组织差异性表达基因（DEGs）。结果显示满足adjusted P value＜0.05且 Log2FC＞1.0 共有25个基因(图1A)，15个显著差异性基因(adjusted P value＜0.05及 Log2FC＞1.5)，其中上调的基因1个，下调基因14个（图1B）。为更好地了解DEGs和膀胱瘤尿路上皮癌之间的关系，我们进一步分析TCGA数据库中的TCGA-BLCA项目（癌旁19列，膀胱上皮癌414例），并分别比较了GSE52519前10个差异性基因在TCGA-BLCA项目中的表达情况（图1C）。与GSE52519变化一致的是DLC1, PRAC1, PLPPR4, ANKDD1A在肿瘤组织中显著下调。鉴于DLC1Log2FC绝对均大于上述其他3个差异性基因，我们选择DLC1做为靶基因以进一步研究，其与MIBUC之间的关系。

接着我们进一步分析DLC1在TCGABLCA项 目 中 非 配 对 样 本（癌 旁：3.92±0.97，肿 瘤：2.45±0.97，P=0.007）及 配 对 样 本（t=-4.990,P＜0.001）中的表达情况，结果显示肿瘤组织DLC1表达均显著低于癌旁组织（图1D, 1E）。据此我们想了解DLC1下调是否可以作为MIBUC的一个指标。进一步行诊断性研究中的ROC曲线分析发现DLC1（癌旁 vs 肿瘤，曲线下面积：0.865，置信区间：0.776-0.954）(图1F)，该结果表明DLC1下调可作为诊断MIBUC的参考指标。

图1 DLC1表达情况分析(A) GSEA52519基因火山图分析。 (B) GSEA52519中15个显著性差异性基因热图。（C）GSEA52519前10个显著差异性基因表达情况。（D-E）TCGA-BLCA项目中DLC1差异性表达情况，（D）非配对样本，（E）配对样本。（F）诊断性研究中的ROC曲线分析

2.2 DLC1基因表达与MIBUC患者临床病理特征相关性分析

为进一步探究DLC1与MIBUC患者临床病理特征间得关系，我们分别对TCGA-BLCA数据中MIBUC患者进行分别进行T、N、M临床分期分析，结果表明正常组织与T1分期中DLC1的表达并无明显差异，但T2、T3、T4期DLC1出现显著下降（图2A）。同样我们观察到N0、N1、N2及N3肿瘤组织中DLC1表达较对照组下调（图2B），M0、M1中DLC1表达也明显低于对照组（图2C）。另外我们还注意到Ⅰ期肿瘤组织DLC1下降不显著，但DLC1的表达明显高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，然而当DLC1下降到一定程度后它的表达并不随着肿瘤分期的增加而改变（图2D）。有趣的是DLC1在中瘤组织中显著下调，且与吸烟、性别、年龄、治疗无关（图2E-H）。为探究DLC1的表达情况是否会影响MIBUC患者生存时间，我们将患者分为高表达DLC1组和低表达DLC1组（表1），并对着两组患者进行生存分析。研究发现总生存期（Overall survival，OS）在DLC1高表达患者和低表达患者中差异有统计学意义（图2I）。

表1 DLC1的表达与临床病理特征相关（逻辑回归）

图2 DLC1表达和临床病理特征的关系，包括（A）T分期，（B）N分期，（C）M分期，（D）病理阶段，（E）性别，（F）年龄，（G）治疗，（H）吸烟，（I）生存曲线分析（总生存期 OS）。

2.3 DLC1在可能参与MIBUC的发生发展

既往研究发现，DLC1在肝癌、肺癌中表达下调，因此我们猜测DLC1表达下调可能与肿瘤有关。为证实该猜想，我们进一步分析了DLC1在泛癌中的表达情况。与我们猜测一致的是DLC1在绝大多数肿瘤中低表达（图3A）。接着我们进一步将TCGA-BLCA项目中MIBUC患者分为DLC1高表达组和低表达组并行基因差异性分析。结果显示共有910个差异性基因，我们进一步行GSEA分析发现差异性基因在肿瘤相关通路路上显著富集（NSE＞1.5,False discovery rate (FDR)＜0.25且p.adjust＜0.05）（图3B-E）。另外我们还发现凋亡相关也被显著富集。既往研究表明凋亡减少可导致中瘤细胞增殖，是肿瘤发生发展的重要机制[20]。据此我们近一步猜测DLC1的下调参与MIBUC发病的病理分子机制。

图3 DLC1高表达组与低表达组差异性基因GSEA富集分析。（A）DLC1基因在多种肿瘤中下调。DLC1高表达组与低表达组差异性基因GSEA富集分析，（B-F）差异性基因在肿瘤相关通路显著富集。

2.4 下调DLC1可能减少MIBUC肿瘤组织免疫浸润

最后我们想进一步了解DLC1下调引起肿瘤的发病的可能机制。因此，我们对DLC1高表达组和地表达组间差异性基因进行GO和功能富集分析发现免疫相关通路被显著富集。进一步在TCGA-BLCA项目中分析DLC1与免疫细胞浸润情况，我们发现DLC1与肿瘤组织中多种细胞免疫浸润有关（图4A-B），其中T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD8T淋巴细胞、DC细胞、巨噬细胞、NK细胞、T辅助细胞、Th1、Th17细胞在DLC1高表达组显著富集（图4C），且DLC1分别予T淋巴细胞、B淋巴细胞、DC细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞呈正相关关系（图4D-I）。考虑到DLC1与上述免疫细胞有关，而MIBUC患者肿瘤组织中DLC1显著下调。据此，我们猜测MIBUC发病可能与中瘤细胞DLC1下调后导致免疫细胞浸润减少有关。

图4 DLG1的表达水平与肿瘤微环境中的免疫浸润有关。（A）DLC1相关差异性基因在免疫相关通路富集。（B）24种免疫细胞的相对丰度与DLC1表达水平之间的相关性。（C-I）箱线图和相关性图显示DLC1高组和低组之间T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和Th17细胞浸润水平的差异。

3 讨论

目前DLC1在MIBUC中的表达情况及对MIBUC的影响尚未见相关报道。同时考虑到DLC1在多项肿瘤组织中表达下调，可能与肿瘤的发病有关[16]，在这项研究中我们将分析DLC1在MIBUC中的作用。我们通过对GEO数据库及TCGA数据库相关RNA测序数据发现DLC1下调可能是MIBUC的一个重要的发病机制及诊断指标。

DLC1在抑制实体瘤发展方面起着不可或缺的作用[21]。DLC1可通过抑制Rho信号通路抑制肿瘤细胞迁移及侵袭[22]当DLC1下调可导致DLC1-RhoARock1信号激活进而促进肿瘤细胞迁移及侵袭[22-23]。在该项目中，无论是GSE52519数据集，还是TCGABLCA项目，DLC1在MIBUC肿瘤组织的表达均显著低于癌旁组织，且TCGA-BLCA项目中DLC1高表达组与低表达组间的差异性基因在肿瘤相关的通路中显著富集。上述结果表明DLC1表达下调可能通过PD1信号通路、EGFR信号通路、CTLA4信号通路及PI3K等肿瘤相关信号通路促进MIBUC发病。

另外多项研究表明DLC1具有促进细胞凋亡[24]，抑制肿瘤细胞增殖的作用[25]。沉默DLC1可抑制胆囊癌细胞凋亡，然而在过表达DLC1的胆囊癌细胞中DLC1可通过促进线粒体向细胞质释放细胞色素C，激活的凋亡信号通路，促进Bax和裂解的caspase-3/8/9的表达，并抑制Bcl-2[24]。另外在肝细胞肝癌HCC细胞系中，过表达DLC1导致RhoA水平明显下降，最终诱导HCC凋亡增加[26]。同样在该项研究中我们发现抑制凋亡相关蛋白在DLC1低表达组显著富集，提示MIBUC发病可能与DLC1下调导致的促凋亡功能障碍有关。

最后，我们的研究发现DLC1可能具有免疫促进的作用，虽然目前尚未见相关文章报道DLC1与肿瘤免疫之间的关系。但在本研究中，我们发现DLC1与多种免疫细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞、DC细胞等成正相关关系。据此我们推测DLC1可能通过促进多种淋巴细胞浸润，抑制肿瘤形成。而DLC1表达将低，可导致异型（异常）细胞清除减少，最终导致中瘤细胞形成及增殖。因此关于DLC1促进肿瘤免疫的研究需进一步实验及临床证实。

这项研究中，我们发现DLC1在MIBUC肿瘤组织中显著下调，它可能通过促进肿瘤细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡促进肿瘤的发生发展，同时中瘤组织中下调的DLC1无法促进免疫细胞向肿瘤组织浸润，进而导致肿瘤免疫抑制，进一步促进肿瘤发生发展。据此我们可以认为DLC1具有肿瘤抑制作用，尽管具体的机制需要通过实验深入研究。