肉桂醛对乳腺癌细胞MDA-MB-231活性影响的研究

陈伟，覃成禹，陈远明

（1.广西医科大学，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第二附属医院，广西 南宁 530007；3.广西再生医学重点实验室，广西 南宁 530021）

0 引言

据2020年世界卫生组织报告，在女性癌症患者中，乳腺癌已超越肺癌成为发病率最高的肿瘤[1]。而在乳腺癌晚期患者中，约有65%-75%会发生骨转移[2]。三阴性乳腺癌是乳腺癌分子分型中的一种，与其它分型的患者相比，其早期远处复发率更高，5年预后更差；肿瘤体积更大，等级更高[3]。化疗药物中长期使用及单一使用易产生耐药[4]，开发新型抗肿瘤药物，推动中药单体抗癌是有必要的。

肉桂醛是一种天然的黄酮类化合物，是药食同源植物肉桂挥发油中的最重要的活性成分之一[5]。现代药理学研究表明肉桂醛具有抗氧化、抗菌、抗炎及抗肿瘤等作用[6-8]。目前，肉桂醛对三阴性乳腺癌的作用研究鲜有报道。本文探讨肉桂醛对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231生长作用，为临床抗肿瘤辅助用药提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及培养

人乳腺癌细胞MDA-MB-231（购自中国医学科学院细胞中心），用含10%胎牛血清、1%青/链霉素溶液的DMEM完全培养基接种，于条件为5%CO2、37℃的培养箱中培养。

1.1.2 主要试剂

肉 桂 醛（索 莱 宝，SC8320），胎 牛 血 清（美仑 生 物，PWL001）,CCK-8试 剂 盒（美 仑 生 物，MA0218），0.1%结晶紫染色液(索莱宝，G1063),逆转录试剂盒（ThermoFisher），AKT抗体（CST，4691），p-AKT抗 体（CST，4060），β-actin抗体（CST，4970），荧光二抗（invitrogen，sa535571）。

1.1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱（ThermoFisher，美国），Tri Star2 多功能酶标仪（Berthold，德国），Cytation 5成像仪（BioTek，美国），NanoDrop超微量分光光度 计(ThermoFisher，美 国），ProFlex PCR仪(Life technologies，美 国)，LightCycler实 时 荧 光 定 量PCR仪（Roche，瑞士），PowerPac电泳系统(BIORAD，美国)，双色红外激光成像系统（基因有限公司，中国香港）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8药物毒性实验

取生长状态良好的MDA-MB-231细胞，以每孔5×103个细胞、100μL完全培养基（含10%胎牛血清及1%青、链霉素双抗）接种于96孔板中，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中孵育过夜。第二天见板内细胞贴壁生长，状态良好，更换培养基为含不同浓度肉桂醛（0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmoL/L）的完全培养基后，分别于培养箱中培养24小时、48小时后加入CCK-8试剂，培养箱恒温孵育2小时后上酶标仪机器检测450nm处吸光度。

1.2.2 克隆形成实验

将MDA-MB-231细胞以1 000/孔接种于六孔板内，待细胞贴壁状态稳定后，改培养基为分别含0、6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L肉桂醛的30%胎牛血清的完全培养基，培养箱孵育7天或镜下观察见对照孔中大多数单个克隆中细胞数大于50为止，4%多聚甲醛固定细胞， 0.1%结晶紫染色液染色，成像仪拍照。

1.2.3 划痕愈合实验

取生长状态良好的MDA-MB-231细胞，以每孔5×105个细胞、2mL完全培养基接种于6孔板中，待细胞贴壁铺满孔底后，吸头划痕后用PBS轻微清洗，分别加入含0、25、50、100μmoL/L肉桂醛的无血清培养基放入培养箱中培养。分别于加药后0、24、48 h显微镜下拍照记录划痕愈合情况。划痕愈合率=（0h划痕面积-该时段划痕面积）/（0h划痕面积）。

1.2.4 聚合酶链式反应

将MDA-MB-231细 胞 以1.5×105/孔 接 种 于六孔板内,不同浓度肉桂醛处理24 h后，TRIZOL法提取总RNA，根据逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA。美国国家生物信息中心（NCBI）网站Gene模块设计以下引物：CASP3，上游引物5’-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3’，下 游 引 物5’-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3’；CASP9，上 游引物5’-CTCAGACCAGAGATTCGCAAAC-3’，下游引物5’-GCATTTCCCCTCAAACTCTCAA-3’；BCL2，上游引物5’-GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3’;下游引物5’-AGTTCCACAAAGGCATCCCAG-3’；BAX，上游引物5’-GGAGCTGCAGAGGATGATTG-3’，下游引物5’-GGAGACAGGGACATCAGTCG-3’;GAPDH，上 游引物5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3’，下游引物5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3’。qPCR反 应 条件为95℃ 60 s孵育，40个扩增循环（95℃ 15 s，60℃ 60 s），熔解冷却。以GAPDH作为管家基因，实验所得Cq值按照2-△△cq计算出各目的基因的相对表达量。

1.2.5 蛋白质免疫印迹实验

将MDA-MB-231细胞以2×105/孔接种于六孔板内，分别以0、6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L浓度的肉桂醛处理细胞24h后,加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂、PMSF、磷酸酶抑制剂）提取蛋白。1.0 mm玻璃板制10%分离胶， 120 V，80 min条件下电泳，300 mA，90 min参数将蛋白转印至0.45 µm硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1h，一抗（p-AKT、AKT、β-actin）4℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育1 h后上机扫描成像。

1.2.6 数据处理

克隆形成、划痕、蛋白质免疫印迹实验所得原始图使用ImageJ软件进行量化，实验数据均以GraphPad Prism8统计软件处理，以0μmoL/L组（不含肉桂醛的完全培养基组）作为对照组，组间比较使用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 肉桂醛对乳腺癌细胞的增殖/毒性影响

通过CCK-8细胞增殖毒性实验，我们发现肉桂醛浓度在50 μmoL/L以上时对乳腺癌MDAMB-231细胞具有毒性作用（P＜0.05），且随着浓度升高，其毒性越强（图1）。计算肉桂醛处理MDAMB-231细胞48 h时的半数致死量IC50值为103.6 μmoL/L，取100 μmoL/L为肉桂醛后续实验的最能和用药终浓度。

图1 肉桂醛对乳腺癌细胞增殖毒性的影响（＊＊表示P＜0.01,＊＊表示P＜0.001）

2.2 肉桂醛对乳腺癌细胞克隆形成能力的影响

我们发现在6.25-100 μmoL/L范围内，随着肉桂醛浓度增加，MDA-MB-231细胞克隆形成数目递减（图2）,表示肉桂醛能够抑制乳腺癌细胞克隆形成能力。

图2 肉桂醛对乳腺癌细胞克隆形成能力的影响

2.3 桂醛对乳腺癌细胞迁移能力的影响

通过划痕愈合实验，我们发现肉桂醛浓度在100 μmoL/L时，抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力（P＜0.001）（图3）。

图3 肉桂醛对乳腺癌细胞迁移能力的影响(＊＊＊表示P＜0.001)

2.4 肉桂醛对乳腺癌细胞mRNA表达水平的影响

经肉桂醛处理后，乳腺癌细胞中的CASP3、BCl2表达水平下降（P＜0.001或P＜0.01）、CASP9和BAX表达水平增高(P＜0.01或P＜0.05)(图4)，表明肉桂醛可能通过诱导凋亡来抑制乳腺癌细胞的生长。

图4 肉桂醛对乳腺癌细胞凋亡相关基因表达的影响(＊表示P＜0.05,＊＊表示P＜0.01,＊＊＊表示P＜0.001)

2.5 肉桂醛对AKT蛋白磷酸化情况的影响

通过蛋白质免疫印迹实验，我们发现肉桂醛能够激活AKT通路，并且随着药物浓度增加，p-AKT蛋白占总AKT蛋白的比例增加（图5）。

图5 肉桂醛对AKT信号通路的影响

3 讨论

我们在该实验研究中，通过CCK-8法探究了肉桂醛对乳腺癌细胞的增殖毒性，克隆形成实验及划痕实验探究肉桂醛对乳腺癌细胞克隆形成和迁移能力的影响，采用qPCR分析凋亡相关基因（CASP3、CASP9、BCL2和BAX）的表达，以及WB实验探究肉桂醛对AKT通路激活的影响。研究结果表明，肉桂醛降低了人乳腺癌细胞MDAMB-231增殖、克隆形成、以及迁移能力。经肉桂醛处理后，乳腺癌细胞中的BAX表达水平上升，BCL2表达水平下降，可能是BCL2与BAX基因协同诱导线粒体依赖性凋亡[9]；CASP3表达水平下降而CASP9表达水平升高，可能是抑制乳腺癌发生、发展的机制[10]。肉桂醛作用于乳腺癌细胞后，AKT通路激活。

抑制PI3K-AKT信号通路起抗肿瘤作用得到广泛验证[11-12]，但我们实验中发现肉桂醛能够抑制乳腺癌细胞的生长，且在测定范围内抑制作用与浓度呈正相关，然而肉桂醛对AKT蛋白的磷酸化也随着浓度而增多。不同细胞之间，不同药物发挥作用所激活的通路不尽相同[13]； LI L等发现，榄香烯诱导肿瘤凋亡，却也在短时间内使AKT和ERK通路激活[14]。由于信号通路串扰的存在[15]，探明药物发挥作用的分子机制需要进一步实验探究，如增加不同时段AKT激活情况及ERK1/2通路的激活情况等。

在本研究中，只探讨了肉桂醛对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用，并未对其侵袭能力及骨转移。进一步明确肉桂醛体外抑制乳腺癌细胞分子机制后，可以探究对转移相关基因表达以及体内实验验证。

4 结论

在体外实验中，肉桂醛能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖活性、克隆形成能力以及细胞迁移能力，以及诱导细胞凋亡。