基于斑马鱼模型的8-姜烯酚抗血管作用研究

2022-08-24 08:09潘烨灿孟瑞媛卯明彩钱永忠
农产品质量与安全 2022年4期
关键词:斑马鱼胚胎实验组

冯 悦 潘烨灿 孟瑞媛 卯明彩 邱 静 钱永忠

(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 农业农村部农产品质量安全重点实验室, 北京 100081)

生姜是草本植物姜的根茎, 是常用的药食两用中药材。 近年来, 国内外研究发现生姜具有抗炎镇痛、 降血糖血脂、 抗抑郁、 止呕等作用, 可以用于治疗糖尿病、 关节炎、 神经性炎症、 术后呕吐等疾病, 并且可以预防阿尔茨海默症及部分癌症[1]。生姜中重要的特征成分是姜辣素类化合物[2], 其可分为姜酚类、 姜烯酚类、 姜酮类等不同类型, 主要成分有 6-姜酚、 8-姜酚、 10-姜酚、 6-姜烯酚、8-姜烯酚、 10-姜烯酚和6-姜二酮等[3]。

动物模型是研究人类疾病的重要工具[4]。 近年来, 斑马鱼凭借其体积小、 生殖周期短、 基因组和人类基因组有高度同源性等优势, 已经成为国际认可的新型模式生物[5]。 目前, 斑马鱼已被应用到评估抗血管生成药物的模型系统中, 利用其胚胎研究抗血管生成剂的报道越来越多[6]。 斑马鱼转基因品系Tg(fli1∶EGFP)凭借其在荧光显微镜下清晰可见的血管, 已经成为广泛应用于食品、 药物研究领域的一种理想的抗血管生成高通量药物筛选模型[7],被用于评估化学合成小分子或天然产物的抗血管生成活性[8]。 转基因斑马鱼Tg(fli1∶EGFP)是将 friend leukemia integration 1 (Fli1) 转录因子与增效绿色荧光蛋白 (EGFP) 结合, 导致EGFP在胚胎的所有血管中普遍表达。 这些转基因斑马鱼胚胎血管系统的时间延迟成像显示, 斑马鱼已经存在的血管系统中有节段间血管 (ISV)、 肠下静脉血管(SIV)和背纵吻合血管(DLAV)的萌芽[9]。 斑马鱼的血管发育与人类等高级脊椎动物非常相似, 开始于原肠胚形成时期, 并贯穿于整个生命过程[10]。 目前, 利用斑马鱼分析天然植物提取物是否具有抗血管生成作用已经成为新的研究热点。 MUHAMMAD 等[11]通过斑马鱼胚胎实验测试, 发现天丹植物提取物会抑制斑马鱼 ISV、 SIV 和 DLAV 的形成。 LAM 等[12]通过实验发现诺比列酮破坏斑马鱼ISV 的形成。 还有学者研究发现, 肉桂[13]、 硫酸多糖[14]等一些天然提取物均会抑制斑马鱼新生血管的形成。

1971 年, FOLKMAN[15]通过研究提出血管是肿瘤发生和发展基础的观点, 他认为肿瘤的生长分为无血管期和血管期, 在后续研究中, 他进一步提出, 通过抑制肿瘤血管生成来切断肿瘤的血液和营养成分供应从而达到阻止肿瘤生长和转移的治疗方法, 这种治疗方式也称为 “抗血管生成治疗”。 目前, 大量的研究证实血管在肿瘤的生长与转移中起到关键性作用[16]。 在肿瘤的生长过程中, 需要周围血管提供比正常组织更充足的营养和氧气, 同时也需要血管运输呼吸和代谢废物。 因此, 肿瘤的发生、 发展往往会刺激正常休眠的血管系统萌芽出新的血管, 来帮助和维持肿瘤的生长, 并为部分肿瘤细胞转移提供途径。 以肿瘤血管为治疗靶点, 抑制其生成或破坏其存在就可以切断肿瘤的营养供应,最终达到抑制肿瘤快速生长、 转移的目的。 目前,抑制肿瘤血管生成已经成为肿瘤治疗的新策略, 而且这种治疗方式对机体产生的毒副作用小[17]。

血管形成初期主要由血管内皮生长因子(VEGF)介导, VEGF 促进血管内皮细胞的分化、 增殖和迁移, 是血管生成的关键参与者。 抑制VEGF 等关键血管生成因子可以抑制新生血管的生成。 VEGF相关基因家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盘生长因子 (PGF)[18]。 通常人们所说的 VEGF 一般为 VEGF-A。 VEGF-A 不仅在正常胚胎血管发育和肿瘤血管生成中发挥重要作用[19],还对维持成熟血管的稳态和调节血管渗透性有关键作用[20], 所有血管化组织均可表达VEGFA。 人类VEGFA基因由8 个外显子组成, 经过选择性外显子剪接, 得到由 121、 145、 165、 189 和 206 个氨基酸残基组成的5 种异构体, 分别命名为VEGF121、VEGF145、 VEGF165、 VEGF189、 VEGF206[21]。 在 斑 马鱼中, 存在人VEGFA基因的同源基因vegfaa和vegfab[22]。vegfb、vegfc和vegfd在早期斑马鱼胚胎中均有大量表达, 而vegfc[23]主要表达于斑马鱼的心脏、 肾脏、 肺和血管平滑肌细胞等。 Flt4 是一种Vegf 受体, 由特异性配体Vegfc 激活后产生的信号通路可以促进血管生成和淋巴管生成[24]。

因此, 本文采用血管特异性转基因荧光斑马鱼Tg(fli1∶EGFP), 通过分析 8-姜烯酚对斑马鱼胚胎 SIV 生成、 活性氧 (ROS) 含量、 腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP) 水平以及血管生成相关基因vegfaa、vegfc、flt4表达的影响, 来进行 8-姜烯酚抗血管生成作用及机制研究, 以期寻找新的潜在的天然抗肿瘤成分。

一、 材料与方法

(一) 动物、 材料与试剂转基因斑马鱼fli1∶EGFP购自国家斑马鱼资源中心。 将成年的雌雄斑马鱼分开饲养在养殖系统内, 养殖水为处理后的纯水, 调节 pH 与电导率后使用, 缸内环境 pH 为7.5±1, 水温维持在 (28.5±1)℃, 光暗周期为 14 h/10 h, 每日喂食斑马鱼丰年虾2 次、 高蛋白固体饲料1 次。

8-姜烯酚标准品 (纯度≥99.8%, 天津阿尔塔科技有限公司); S0026 ATP 检测试剂盒、 S0033M活性氧检测试剂盒、 P0010S BCA 蛋白浓度测定试剂盒 (碧云天生物技术有限公司)。

三氯甲烷、 异丙醇、 无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司); 二甲基亚砜 (DMSO, 北京百灵威科技有限公司)。

(二) 仪器与设备斑马鱼养殖系统 (中国海圣有限公司); SZX2-ILLT 体式显微镜、 BX53 荧光显微镜 (日本 Olympus 公司); RXM 智能型人工气候箱 (中国江南仪器厂); ST 16R 高速冷冻离心机 (美国 Thermo Fisher 公司); SCDEALL VXIII 多管涡旋振荡仪 (北京踏锦科技有限公司);Q800R3 超声波仪 (美国Qsonica 公司); 荧光定量PCR 仪 (上海宏石医疗器械有限公司)。

(三) 实验方法

1. 活性成分暴露液的配制。 根据预实验的结果, 称取适量8-姜烯酚标准品, 用DMSO 溶解至终浓度2 000 mg/L, 将药液装至10 mL 棕色玻璃瓶中, 做好浓度、 名称和时间等标记, 放置于-20℃冰柜保存备用。

2. 斑马鱼胚胎的筛选和暴露。 试验前一天晚上将4~6 月性成熟的雌雄转基因斑马鱼fli1∶EGFP以1∶1 的比例放入带隔板的产卵缸中, 次日早上9 点开灯后抽去隔板, 约2 h 后收集胚胎, 胚胎用纯水冲洗3 次后在体式显微镜下挑选发育正常且处于同一发育时期的斑马鱼胚胎, 放置在6 孔板中, 每孔30 枚胚胎及 3 mL 斑马鱼培养水。 分别设置空白对照组(仅有3 mL 培养水)、 溶剂对照组(DMSO 的最终浓度为0.1%)、 8-姜烯酚不同浓度实验组 (8-姜烯酚最终浓度为 50、 200、 500、1 000 mg/mL)、 阳性药对照组 (PTK-787 最终浓度为1 μg/mL)。 给药后放入28℃恒温培养箱培养,每24 h 更换培养水重新给药。

3. 抗血管生成效果观察。 给药 3 d 后, 在不同实验组转基因斑马鱼fli1∶EGFP中分别随机选取10 条幼鱼, 用荧光显微镜观察转基因斑马鱼fli1∶EGFP幼鱼血管的发育情况, 拍照并记录, 以分析8-姜烯酚对转基因斑马鱼fli1∶EGFP胚胎血管生成的影响。

4. 评估8-姜烯酚对斑马鱼发育的毒性作用。在受精后 48、 72、 96 h (hpf), 使用体式显微镜观察各实验组胚胎发育情况, 对胚胎是否受精卵凝固、 是否缺乏体节形成、 是否尾部不脱落、 是否无心跳活力、 是否存在大体形态缺陷进行目视检查。

5. ROS 含量测定。 每组实验组取 30 条幼鱼(72 hpf, 质量约 10 mg), 置于 1.5 mL 离心管内,加入 100 μL 磷酸盐缓冲液 (PBS), 在 0℃下超声破碎 5 min, 4℃条件下 8 000 g 离心 10 min, 置冰上待用。 在 1.5 mL 离心管内, 取 95 μL 上清液,最后加入 5 μL 稀释 100 倍(100 μmol/L)后的探针。锡箔纸避光, 转移至1.5 mL 离心管内, 置于恒温振荡器上, 37℃条件下 150 r/min 孵育 30 min。 孵育结束之后再转移至96 孔板内, 使用酶标仪在激发波长488 nm、 发射波长525 nm 处进行测定。

6. ATP 水平测定。 每组实验组取 30 条幼鱼(72 hpf, 质量约 10 mg), 置于 1.5 mL 离心管内,每组加入 100 μL 裂解液, 在 0℃下超声破碎 10 min, 裂解后在 4 ℃条件下 12 000 g 离心 5 min,取上清液, 用于后续的测定。 加入 100 μL ATP 检测工作液到检测管内。 室温放置3~5 min, 以使本底性的ATP 全部被消耗掉, 在检测孔或检测管内加入20 μL ATP 样品或标准品, 迅速用移液枪混匀, 至少间隔2 s 后, 使用多功能酶标仪的luminometer 功能进行检测。 使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白量, 以消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差。

7. 总 RNA 提取。 加 1 mL 的 Trizol Reagent 至匀浆管, 置于冰上预冷, 另取 100 mg 组织, 加入匀浆管中, 使用匀浆仪充分研磨直至无可见组织块后振荡混匀, 静置 1 min, 以 12 000 r/min 离心 10 min 后取上清液。 加入 250 μL 三氯甲烷, 颠倒离心管 30s, 充分混匀, 静置 5min, 在 4℃下以 12 000 r/min 离心15 min, 将上清液转移到新的离心管中,加入0.8 倍体积的异丙醇, 颠倒混匀后在-20℃冰箱放置 20 min。 在 4℃下以 12 000 r/min 离心 10 min, 得到的管底白色沉淀为RNA。 吸去多余液体,加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀, 在4℃下以12 000 r/min 离心 5 min。 重复洗涤 1 次, 将多余液体吸除干净, 将离心管置于超净台上静置1 min 后加入适量 RNase free water 溶解。 最后, 在 55℃ 孵育 5min。检测RNA 浓度及纯度, 并对浓度过高的RNA 进行适当比例的稀释, 使其终浓度达到1 000 ng/μL。

8. 应用实时荧光定量PCR 技术检测血管生成相关基因的表达。 依据说明书用cDNA 合成试剂盒反向转录RNA, 然后使用荧光定量PCR 仪进行实时荧光PCR。 以cDNA 为模板, 加入相关引物用荧光定量PCR 仪扩增各目的基因。 扩增结束后,以β-actin为内参基因, 用 2-ΔΔCt相对定量法计算各基因的mRNA 相对表达量。 引物序列见表1。

表1 实验所用引物及其序列

(四) 数据处理与统计分析使用SPSS 25.0 软件对实验结果进行单因素方差分析, 结果以平均值±标准差表示,P<0.05 表示数据具有统计学意义。

二、 结果与分析

(一) 8-姜烯酚对斑马鱼胚胎SIV生成的抑制作用通过用不同浓度的8-姜烯酚对斑马鱼Tg(fli1∶EGFP) 胚胎进行处理, 确定了当 8-姜烯酚剂量为500、 1 000 mg/mL 时, 斑马鱼胚胎的 SIV具有较为明显的抑制作用 (见图1), 且呈现剂量相关性。 如图1 所示, 与空白对照组相比, 当剂量为500 mg/mL 时, 斑马鱼肠下静脉血管新生面积明显缩小。 当剂量为1 000 mg/mL 时, 实验组斑马鱼肠下静脉血管生成出现缺失。 此外, 溶剂对照组胚胎的SIV 是完好无损, 发育正常的。 实验组与阳性药对照组的斑马鱼肠下静脉血管均出现了形态的异常或缺失, 抑制作用与药物浓度呈正相关。

图1 8-姜烯酚对斑马鱼Tg(fli1∶EGFP) 肠下静脉血管生成的抑制作用

(二) 8-姜烯酚对斑马鱼胚胎的发育毒性对本文实验浓度下8-姜烯酚对斑马鱼胚胎是否具有发育毒性进行了观测。 结果发现, 用8-姜烯酚处理后的斑马鱼胚胎中没有观察到明显的发育异常(见图 2)。 如图 2 所示, 在 48、 72、 96 hpf 时, 实验组胚胎的发育和表型与空白对照组胚胎相似, 各剂量实验组均无明显的致胚胎死亡和畸形的趋势。因此, 使用本文实验浓度进行8-姜烯酚抗血管治疗时, 不会产生明显的毒性作用。

图2 8-姜烯酚对 48 hpf、 72 hpf、 96 hpf 斑马鱼Tg(fli1∶EGFP) 生长发育的影响

(三) 8-姜烯酚对斑马鱼胚胎中ROS 产生的抑制作用为明确8-姜烯酚对斑马鱼SIV 的抗血管作用机制, 对给药后72 hpf 的斑马鱼Tg(fli1∶EGFP) 胚胎的ROS 含量进行了检测, 结果见图3A。 由图 3A 可知, 与空白对照组相比, 500 mg/mL、 1 000 mg/mL 8-姜烯酚实验组均会抑制斑马鱼胚胎中的ROS 生成, 8-姜烯酚浓度高时, 斑马鱼胚胎中的ROS 降低趋势更明显。 与空白对照组相比, 500 mg/mL、 1 000 mg/mL 8-姜烯酚实验组 ROS 相对含量极显著下降 (P<0.01), 阳性药对照组 ROS 相对含量显著升高 (P<0.05)。 ROS 相对含量的下降表明8-姜烯酚可能通过ROS-Vegf 信号通路发挥抑制血管生成的作用, 因此后续实验对8-姜烯酚对斑马鱼胚胎中血管生成相关基因表达的影响进行了研究。

图3 8-姜烯酚对斑马鱼胚胎中ROS (A) 含量和ATP (B) 水平的影响

(四) 8-姜烯酚对ATP 消耗和线粒体功能障碍的抑制作用为进一步研究8-姜烯酚是否对线粒体功能具有保护作用, 本文对给药后的斑马鱼胚胎的ATP 水平进行了检测。 每组取30 个胚胎, 在6 hpf 将溶解在DMSO 中的8-姜烯酚加到胚胎培养水中, 使其最终工作浓度为500、 1 000 mg/mL,在28℃下处理胚胎72 h。 ATP 检测结果见图3B。如图3B 所示, 与空白对照组相比, 8-姜烯酚有效提高了斑马鱼胚胎的ATP 水平, 1 000 mg/mL 8-姜烯酚实验组 ATP 相对水平显著上升 (P<0.05)。该研究结果说明8-姜烯酚可能对线粒体功能具有保护作用, 但仍需要进一步的研究来证明。

(五) 8-姜烯酚对斑马鱼胚胎中血管生成相关基因表达的影响研究发现, 8-姜烯酚会抑制斑马鱼胚胎中ROS 的生成, 为了验证8-姜烯酚是否通过ROS-Vefg 途径抑制斑马鱼胚胎的SIV 生成,本文采用实时荧光定量PCR 技术对血管生成相关基因vegfaa、vegfc、flt4的 mRNA 相对表达量进行了测定, 结果见图4。 由图4A 可知, 与溶剂对照组相比, 500 mg/mL 8-姜烯酚实验组vegfaamRNA相对表达量下调, 1 000 mg/mL 8-姜烯酚实验组与阳性药对照组vegfaamRNA 相对表达量显著下调 (P<0.05)。 由图 4B 可知, 与溶剂对照组相比,500 mg/mL 8-姜烯酚实验组、 1 000 mg/mL 8-姜烯酚实验组vegfcmRNA 相对表达量极显著下调(P<0.01), 阳性药对照组vegfcmRNA 相对表达量高度显著下调 (P<0.001)。 由图 4C 可知, 500 mg/mL 8-姜烯酚实验组、 1 000 mg/mL 8-姜烯酚实验组flt4mRNA 相对表达量极显著下调 (P<0.01), 阳性药对照组flt4mRNA相对表达量高度显著下调 (P<0.001)。 结果显示, 与溶剂对照组相比, 各组mRNA 相对表达量均下降, 且具有浓度依赖性。 该结果表明, 8-姜烯酚能够抑制斑马鱼胚胎血管生成相关基因的表达。

图4 8-姜烯酚对斑马鱼Tg(fli1∶EGFP) 血管生成相关基因 vegfaa (A)、 vegfc (B)、 flt4 (C) 表达的影响

三、 讨论

生姜是人们生活中常用的调味品, 也是一种中药材。 研究表明, 生姜的化学成分复杂, 具有抗炎、 抗菌、 抗氧化、 抗肿瘤等多种药理作用[25]。 目前有关于生姜抗肿瘤作用的研究主要集中在姜辣素成分, 且多集中于其中的姜酚、 姜烯酚、 姜酮等[26]。6-姜酚作为姜酚类最主要的成分[27], 其在抗肿瘤领域被广泛研究[28], 但国内外关于生姜其他成分抗肿瘤的相关研究很少, 8-姜烯酚抗肿瘤作用的研究更是未见报道。 本文中, 8-姜烯酚处理导致血管特异性转基因荧光斑马鱼SIV 生成被抑制, 从而证明了8-姜烯酚具有抗血管生成功能。

与哺乳动物相似, Vegfaa 对斑马鱼体内的血管生成发挥着至关重要的作用[29], 抑制vegfaa基因表达会导致斑马鱼轴向血管及节段间血管不能正常生长发育[30]。 本文中高浓度8-姜烯酚实验组vegfaa、vegfc、flt4mRNA 相对表达量均下调, 说明 8-姜烯酚可以通过调控血管内皮细胞中的血管内皮生长因子受体基因flt4, 以及内皮细胞之外的血管内皮生长因子配体基因vegfaa和vegfc的表达, 来产生抗血管生成的作用。 有研究表明,flt4不仅在斑马鱼早期发育过程中参与了血管的形成和造血的发生, 还在各种癌组织中存在不同程度的异常表达,并与临床肿瘤分期、 病理分级、 肿瘤淋巴管生成等均有密切关系[17]。 通过对人各种癌症肿瘤组织检查发现FLT4表达水平和VEGFC表达联系密切, 与癌症的临床转移和病人的生存紧密相关[17]。VEGF-C、 FLT4 增强了癌细胞的移动性和侵袭性,促进了癌细胞的转移[31]。 本文中500 mg/mL 8-姜烯酚实验组和1 000 mg/mL 8-姜烯酚实验组的vegfc、flt4基因mRNA 相对表达量均下调, 证明8-姜烯酚具有潜在抗肿瘤作用。

目前, VEGF 受体的信号转导机制已经受到了广泛的关注。 根据研究, ROS 是人的 VEGFR-2 信号转导的中介物[32], 可以刺激诱导 VEGF 分泌[33]。ZHANG 等[34]通过实验发现, G-Rh2 可以以剂量依赖的方式去除KB 细胞的ROS, 通过减少ROS 的产生抑制血管生成的信号, 从而阻断抑制肿瘤的生长和转移。 细胞内高水平的ROS 不仅会参与细胞信号传导、 诱导细胞凋亡, 也是肿瘤及其他许多疾病的共同发病机制, 而且与线粒体损伤关系密切[34]。 本文结果显示, 高、 中浓度的 8-姜烯酚均会抑制斑马鱼胚胎中的ROS 生成, 并有效提高斑马鱼胚胎的ATP 水平。 这说明8-姜烯酚会通过抑制ROS 生成来减少ATP 的消耗, 同时也说明8-姜烯酚可能对线粒体功能具有保护作用, 但仍需要进一步的研究来证明。

四、 结论

综上所述, 8-姜烯酚具有明显的抗斑马鱼血管生成的作用, 可以降低斑马鱼胚胎ROS 的含量,并能有效提高斑马鱼胚胎中的ATP 水平, 通过减少 ROS 的产生,vegfaa、vegfc、flt4基因的表达水平下降, 血管生成的信号被抑制, 肿瘤的生长和转移可以被阻断。 因此, 8-姜烯酚可以通过ROSVefg 信号通路发挥抑制血管生成的作用, 从而可能具有潜在的抗癌效果。

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