稽留流产患者蜕膜组织中NKG2A、NKG2D及其配体的表达及意义

郑 婕 黄汉辉 刘 磊

广州市妇女儿童医疗中心 广东广州 510000

早期妊娠稽留流产(missed early miscarriage，MEM)患者是指妊娠12周内超声判定妊娠囊或胚胎停止生长，或胎心消失且妊娠组织未排出体外者[1]。MEM病因复杂，其中胚胎绒毛染色体异常可高达40%，还有约50%的MEM患者无法查明病因。而在不明原因的流产中，有相当一部分是免疫因素导致的[1-2]。妊娠本身是一种典型的同种免疫移植过程，妊娠组织携带父源基因，正常情况下却能抵抗母体免疫细胞的攻击，目前其机制不明。现有研究显示，自然杀伤(NK)细胞在胚胎植入及蜕膜形成过程中显著增多，是妊娠子宫蜕膜中最主要的免疫细胞，并且其主要聚集在胎盘部位的蜕膜处，提示蜕膜NK细胞在母胎免疫耐受中可能起着非常重要的作用[3-4]。NK细胞表达何种功能取决于其表面受体的表达，受体通过相应配体传递信号进而调节NK细胞的功能。NK细胞表面受体种类较多，其中NKG2A和NKG2D分别是最重要的抑制性和活化性受体[5]。目前关于NKG2受体家族在妊娠组织中的表达及其功能研究较少，本研究通过检测NK细胞表面受体NKG2A、NKG2D及其配体MHC-I类链相关分子A(MHC class I chain related protein A，MICA)在早期稽留流产蜕膜组织中的表达，来探讨NKG2A、NKG2D及其配体MICA在免疫因素稽留流产中的意义，以期为免疫性流产患者的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019年6月—2021年6月在广州市妇女儿童医疗中心就诊的50例MEM患者为MEM组，另选同期50例社会因素人工流产孕妇为对照组。纳入标准：既往月经周期规则、无异常妊娠史、无生殖器官畸形，无内外科疾病、无传染病史、无生殖道感染史、无家族遗传病史、单胎、妊娠期间无异常阴道流血。两组均排除：患者>35岁、复发性流产史、自身免疫性疾病史、胚胎染色体检查结果异常者。本研究经过本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。两组一般情况比较，差异无统计学意义，见表1。

表1 两组患者一般情况比较

1.2 研究方法

1.2.1 采用RT-PCR法检测蜕膜组织中NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表达 采用负压吸引术，在无菌操作下留取两组蜕膜组织，使用PBS缓冲液冲洗。取100 mg蜕膜组织，加入Trizol细胞裂解液1 mL，按说明书提取组织总RNA，每份样品取2.5 μg进行逆转反应合成cDNA，之后进行RCR扩增，同时扩增β-actin作为内参照。各引物由GeneCore公司合成，采用RT-PCR试剂盒进行实验，PCR循环参数设置为：94 ℃变性3 min；94 ℃和56～61 ℃分别为30 s，72 ℃为1 min，循环扩增35次后，72 ℃延伸10 min。使用15%琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像仪检测结果。使用Imange J分析软件系统进行分析，以目的条带的吸光度容积与β-actin条带吸光度容积的比值作为目的条带的相对含量。引物序列、扩增片段长度，见表2。

表2 扩增物、引物序列及扩增片段长度

1.2.2 采用Western Blotting法检测蜕膜组织中NKG2A、NKG2D和MICA蛋白的表达 采用负压吸引，在无菌操作下留取两组蜕膜组织，使用PBS缓冲液冲洗。按100 ∶400 ∶4比例在100 mg蜕膜组织中分别加入细胞裂解液、酶抑制剂，低温离心提取蛋白，将标准蛋白作为对照，采用酶标仪测量OD值以计算蛋白浓度。使用Santa公司生产的兔抗人NKG2A、NKG2D和MICA抗体，样品经凝胶电泳后转NC膜，使用脱脂奶粉封闭4 h后在4 ℃ 1 ∶200一抗中孵育过夜，复温1 h后1 ∶1 000二抗孵育4 h，完成后使用BCIP/NBT显色10～20 min。使用Image J分析软件系统进行分析，以目的蛋白条带的吸光度容积与β-actin条带吸光度容积的比值作为目的蛋白的相对含量。

1.2.3 采用免疫组化(SP)法检测MICA表达部位 使用10%甲醛固定蜕膜和流产绒毛，样品经石蜡包埋、切片、脱蜡后加入0.1 moL/L枸橼酸钠抗原修复液，加入30 mL/L过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，正常血清封闭20 min。加入1 ∶50兔抗人MICA抗体，4℃过夜；按羊抗兔SP试剂盒说明书滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶复合物，采用DAB显色，苏木素复染，镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 蜕膜组织中NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表达

如图1所示，在MEM组和对照组蜕膜组织中，均可见NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表达。在表达量上，MEM组中NKG2A mRNA表达水平低于对照组，而NKG2D和MICA mRNA的表达水平则高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

注：1，MEM组；2，对照组

表3 两组蜕膜组织中NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表达情况

2.2 蜕膜组织中NKG2A、NKG2D和MICA 蛋白的表达

如图2所示，在MEM组和对照组蜕膜组织中，均可见NKG2A、NKG2D和MICA蛋白的表达。在表达量上，MEM组NKG2A蛋白表达水平低于对照组，而NKG2D和MICA 蛋白表达水平则高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

注：1，MEM组；2，对照组

表4 两组蜕膜组织中NKG2A、NKG2D和MICA蛋白表达情况

2.3 MICA蛋白表达部位

如图3 所示，免疫组化显示在滋养细胞和蜕膜基质细胞中均可见MICA蛋白的表达。

图3 滋养细胞和蜕膜基质细胞中均可见MICA表达(×400)

2.4 NKG2A、NKG2D及MCIA相关性分析

经Pearson相关性分析发现，NKG2A与NKG2D、MCIA mRNA呈负相关(r=-0.68、-0.72，P<0.05)；NKG2A与NKG2D、MCIA 蛋白呈负相关(r=-0.77、-0.75，P<0.05)；NKG2D与MCIA mRNA呈正相关(r=-0.68、-0.72，P<0.05)。

3 讨论

蜕膜化是指胚胎植入子宫过程当中子宫内膜间质细胞转化为蜕膜细胞的过程，在这个过程当中绒毛外滋养层细胞植能够植入蜕膜化的子宫内膜当中，这一过程为胚胎的发育提供了物质保障，同时蜕膜基质细胞与母体局部免疫反应密切相关，与蜕膜基质相关的一些因素能够导致一系列胎儿妊娠反应，比如MEM的发生[6]。目前研究表明，免疫因素是在MEM发病的重要因素之一。胎儿与母体存在着类似于同种异体移植的免疫学关系：正常妊娠中，母胎之间免疫调控达到平衡，即免疫耐受；而免疫耐受一旦遭到破坏，母体会对胎儿产生免疫攻击，由此引发流产[7]。各种免疫因素中，NK细胞是妊娠子宫中数量最多的免疫细胞，这提示NK细胞可能在妊娠子宫内免疫调控中发挥着至关重要的作用[8-9]，其可通过各种细胞因子调节滋养层细胞的功能，进而影响胎儿发育的过程[10]。因而，对胚胎发育过程中NK细胞相关途径进行研究或许能够揭示MEM发生的深层次原因。

在子宫蜕膜化过程中，NK细胞会急剧增加[11]，增加的NK细胞参与了多种进程，维持了母体妊娠过程的正常进行。NK细胞的功能取决于其表面受体，但NK细胞表面受体种类众多，究竟何种受体作用最重要目前尚不清楚。目前，对于NKG2A和NKG2D这两种受体的研究逐渐受到关注，研究发现，在白血病、胰腺癌等恶性肿瘤中，二者间表达失衡的情况下会导致肿瘤免疫逃逸[12-14]。而在子痫前期患者，已有研究证实，患者外周血和脐血NK细胞数量显著增高，且增殖活性和杀伤活性明显增强；同时妊娠期子宫NK细胞NKG2A表达远高于外周血，推测子痫前期患者除存在全身免疫失衡外，还可能存在蜕膜局部免疫改变，从而影响滋养细胞功能[15-16]。MEM与子痫前期有一致的病理生理基础——滋养细胞侵蚀及螺旋动脉重铸，但在MEM患者子宫中是否有类似的免疫改变，目前研究还较少。

NKG2A是NK细胞最重要的抑制性受体，滋养层NKG2A与配体HLA-E特异性结合后，抑制子宫NK细胞活化，从而阻止其杀伤胚胎组织[17]。NKG2D则是NK细胞表面活化性受体之一，对NK细胞有较强的活化作用。本研究显示在MEM患者当中，相比于对照组，NGK2A表达降低而NGK2D表达升高，因此我们推测在子宫蜕膜当中抑制性受体NKG2A与活化性受体NKG2D共同发挥作用，维持某种平衡，使得NK细胞的活性处于较为合适的程度并进而形成母胎免疫，既确保了胎儿的正常发育又有效地行使着免疫功能。同时，相关性分析显示NKG2A与NKG2D存在负相关，这也验证了二者之间存在某种联系，共同调控MEM的发生，但这还需要进一步的研究进行验证。NKG2D作为活化性受体，与其他活化受体不同的是，其能通过自身形成同二聚体而发挥作用，但目前其作用途径尚不清楚[18]。MICA是NKG2D的主要配体，是一种跨膜蛋白。研究显示，NKG2D可通过与MICA结合，在多肽DAPL0的介导下激活NK细胞[19]。本研究显示在MEM患者当中，MICA蛋白广泛分布于滋养细胞和蜕膜基质中，且其表达显著高于对照组(P<0.05)。这说明在MEM患者当中，MICA可能介导了NKG2D对NK细胞的激活作用：NKG2D表达量升高与高表达的MICA受体结合，向下游传递激活信号从而使得母体对胚胎产生杀伤性作用，导致MEM的产生。

综上所述，本研究显示MEM的发生可能是由于患者蜕膜组织中NK细胞抑制性受体NKG2A表达的减少，而活化性受体NKG2D及其配体表达的增高，这打破了二者之间的某种平衡，活化性受体NKG2D的表达上调，通过结合特异性信号蛋白MICA进行信号传递，使患者发生母胎界面免疫失衡，从而导致MEM的发生。对其分子机制的进一步探究可能为此类患者的治疗提供一定理论基础。