流式细胞仪在水环境中的研究热点和应用——基于Cite Space知识图谱的分析

安志强,王永刚,王 旭,王琦琳 ,李亚翠 ,王恒嘉

(1.首都师范大学资源环境与旅游学院，北京 100089；2.北京市生态环境保护科学研究院，北京 100037；3. 国家城市环境污染控制工程技术研究中心， 北京 100037；4. 天津大学环境科学与工程学院，天津 300072)

引 言

近年来，水环境问题日益突出，水体污染和水质安全等问题引起了人们广泛的关注。某些指示性浮游微生物对自身生存的环境水质的变化较为敏感，其浓度变化在一定程度上反映出水环境的变化情况[1]。目前，对于浮游微生物群落动态监测常采用传统的镜检法，该方法分析速度慢、耗时长，对操作人员的要求较高，难以满足种群动力学观测量大、连续的要求[2]，也就无法保证水环境健康稳定。而流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)的应用，使得这一问题得到了很好的解决。

FCM是以流式细胞术为核心技术，依赖于流体学、光学、电子学的基本原理，集合细胞化学、免疫学以及激光技术、细胞荧光技术等多门学科和技术于一体的先进科学技术设备[3]。自问世以来，被广泛应用于免疫学、血液学和遗传学等临床医学中[4]。直到近些年来，随着光电探测技术的发展和新型荧光染料的开发，并与FCM相结合，可实现对浮游微生物的快速分析 、多参数分析和定向分选以及相关统计数据集的优化等，后逐渐被应用水环境的检测中[5]。

现如今，国内外学者对FCM在水环境中应用的研究成果日益增多，但尚未见到利用知识图谱等文献计量分析方法对FCM在水环境中研究现状系统深入分析研究的报道。鉴于此，本文采用文献计量分析方法系统梳理FCM在水环境研究领域已有的成果，并通过可视化分析方法生成形象直观的知识图谱，以期揭示该领域研究的动态发展规律并展望未来研究方向，为FCM在水环境中的理论与实践研究提供科学依据。

1 研究方法和数据来源

本研究基于在国内外学术界得到广泛应用的 Cite Space 可视化软件[6]，它可以将文献当中潜在的信息挖掘出来，再通过巧妙的空间布局与多元、分时、动态的可视化语言将研究领域的研究热点、研究趋势和发展历程等展现在一张科学知识图谱中，可视化的展现FCM在水环境中的研究热点和发展趋势。

本文所需数据来源WOS核心合集和CNKI数据库，检索时间为2021年2月15日，对检索结果通过人工筛选剔除后，检索结果如表1。

表1 数据来源

2 文献计量分析

2.1 文献数量变化分析

年发文数量能够反映该研究领域不同时期的基本研究情况、发展程度以及学者对该领域的关注度变化。通过对WOS核心合集和CNKI数据库所得近十年数据进行统计，可以得出在2010—2020年间国内外有关FCM在水环境方面研究文献发表的数量变化(图1)。总体来看，英文文献发文数量远远高于中文文献。从变化趋势上看，英文文献发文量总体呈上升趋势，在2018年达到峰值，发文量为117篇，近两年发文量有所下降，平均71篇/年。中文文献发文量变化趋势与英文文献变化趋势相近，但整体发文量较低。

图1 2010—2020年国内外流式细胞仪在水环境中研究文献发文数量变化

2.2 研究关键词的分布及分析

研究关键词的分布及演化最能直观地体现不同时间段的研究领域内的研究风向，而论文主题中的关键词是对论文最为精炼的表达，高频关键词在一定程度上代表相关研究领域的发展动向和研究热点[7]。

基于WOS核心合集所得文献进行可视化分析，得出的知识图谱(图2，a)共包含关键词节点287个、连线1 103条；基于CNKI数据库所得文献进行可视化分析，得出的知识图谱(图2，b)共包含关键词节点14个、连线11条。在图2中，节点越大，表明词频越高，与主题相关性越大；连线表示关键词共现，线条粗细反映共现频次[8]。从图2(a)可以看出，除检索的关键词外，phytoplankton(浮游植物)、bacteria(细菌)、community structure(群落结构)、dynamic(动态的)等关键词节点较大，连线较为密集；从(b)可以看出，浮游病毒、异养细菌、浙江近海、浮游细菌等关键词节点较大，连线较为密集。由此可见FCM集中用于对水域中浮游微生物的检测中，通过FCM高效精确的检测结果，便于掌握浮游微生物的群落结构和动态变化，这也是当下国内外学者研究的热点方向。

图2 2010—2020国内外流式细胞仪在水环境研究领域关键词图谱

2.3 研究热点演化过程

研究热点为某时间段内研究领域中突然出现的最先进和具有发展潜力的研究热点问题。突现词是指在短时间关键词频次突然增加或频次增长率突然提高的研究主题词，其突现强度值和突现期可以反映研究前沿的演化趋势[9]。在Cite Space中对WOS核心合集和CNKI数据库中文献的关键词进行分析，得到关键词的突现图谱和时序图谱。

2.3.1 国外流式细胞仪在水环境研究热点演变

基于WOS核心合集文献研究热点演化可分为两个阶段：

第一阶段为2010—2017年(见图3)，这一阶段突现关键词主要有phytoplankton growth(浮游植物生长)、enumeration(计数)、heterotrophic bacteria(异养细菌)、assimilable organic carbon(可吸收的有机碳)等，其中heterotrophic bacteria突现强度最高，enumeration突现时间最长，在这一时期，由于FCM在水环境中的应用刚刚兴起，学者主要应用其对水域中浮游微生物的丰度进行研究； 第二阶段为2018—2020年，主要突现关键词有bacterial community(细菌群落)、waste water(污水)、biofilm(生物膜)等，其中突现强度最高的为bacterial community、其次为waste water。由此可以得出，近几年国外学者对FCM在水环境中的应用不再局限于对海洋中浮游生物的检测，而是将其转移至饮用水和再生水处理工艺中来，通过水体中细菌的实时检测，来确保水质的安全性。

(a)突现图谱

图3 2010—2020国外流式细胞仪在水环境领域研究热点词突现图谱和时序图谱

Fig.3 Emergence and time series of hot words in water environment research by foreign flow cytometry from 2010 to 2020

2.3.2 国内流式细胞仪在水环境研究热点演变

基于CNKI文献研究热点演化可分为两个阶段：

第一阶段为2010—2016年(见图4)，主要代表突现关键词有湖泊、异养细菌。由此可以看出，早期学者主要是对湖泊进行研究，这与我国内陆湖泊较多，且经常出现环境问题有关，使得国内学者更多的将FCM应用于湖泊中细菌、藻类的监测，预防并治理水环境问题。第二阶段为2017—2020年，主要代表突现关键词为生物稳定性、浮游植物、浮游细菌、饮用水、群落结构等。这一阶段学者除对水域中浮游微生物的动态监测的研究外，同时FCM在饮用水中的应用也做了探究。由此不难看出， FCM在饮用水再生水中的应用成为各国学者的研究热点，也是未来几年研究的发展方向。

2.4 研究机构

图5显示，WOS检索到FCM在水环境研究的文献中研究机构主要有：Chinese Academy of Sciences(中国科学院)、China Shipbuilding Industry Group Co, Ltd. (中国船舶重工集团公司)、University of Chinese Academy of Sciences(中国科学院大学)、Centre national de la recherche scientifique(法国国家科学研究中心)、University of aix-marseilles(艾克斯马赛大学)等；CNKI数据库检索到FCM在水环境研究的文献中研究机构主要有:中国科学院生态环境研究中心中国科学院饮用水科学与技术重点实验室、太湖流域水文水资源监测中心、浙江海洋大学海洋科学与技术学院和中国海洋大学海洋生物遗传学与基因资源利用教育部重点实验室等。

图5 2010—2020流式细胞仪在水环境领域研究机构图谱

2.5 代表作者

图6显示，基于WOS检索文献中代表作者团队主要有：Frederik Hammes、Nico Boon、Ruben Props、Michael D Besmer等人的团队；Wang Yingyin、Liu Jie、Ling Bing、Zhang Guijuan等人的团队；Li Jiajun、Jiang Xin、Tan Yehui团队等和Josep M Gasol、Fernando Unrein团队等。CNKI检索文献中代表作者团队主要有：史小丽、孔繁翔、李胜男、谢薇薇等人的团队；李汝伟、徐大鹏、姚天舜等人的团队；杨琳、孙辉、汪岷等人的团队和毛冠男、王莹莹团队等。

图6 2010—2020流式细胞仪在水环境研究领域代表作者图谱

3 流式细胞仪在水环境中的应用

通过对FCM在水环境中的文献计量分析，可以得出FCM在水环境中的应用主要是对水环境中浮游微生物的检测，以及在饮用水和再生水中细菌病毒的检测。现针对FCM在水环境中的应用热点做一简单概述。

3.1 计数和分选的应用

流式细胞仪最常见的应用就是计数应用，与常规的平板计数法相比较，FCM不仅具有分析速度快、灵敏度高和准确度高等优点，而且可以实现对样品的多参数测定[10]。熊忠亮等[11]进行藻类计数实验，结果显示应用FCM计数结果比传统平板计数更加精确和可靠。吴晓文等[12]对比了FCM和血球计数板计数两种方法，结果显示FCM计数结果的更准确，是一种可以代替血球计数板计数的快速准确的方法。Siebel 等[13]对比了常规平板计数法与流式细胞仪的相关性，发现平板法的测定结果比流式细胞仪检测结果低约2个数量级且不存在任何相关性。由此可以看出，FCM可实现对样品的高精度快速定量检测。

不同类型的浮游微生物应用FCM测定的方法有所区别，对于自养型浮游藻类来说，由于体内含有特定的细胞色素，如叶绿素a和b、藻蓝素、藻红素等，可根据细胞所含色素的不同来进行区分和计数。而对于大部分浮游细菌和病毒细胞内不含色素，因此还需要借助荧光染料对细胞核酸进行染色处理，目前，SYTO-13和SYBR Green Ⅰ是最适用于自然水体浮游细菌计数的荧光染料，其使用率也最高。Marc等[14]利用FCM对SYTO-13荧光染剂染色的浮游细菌进行计数，发现与荧光显微镜计数有很好的相关性。Marie等[15]通过 SYBR Green Ⅰ染色首次利用标准流式细胞仪成功地检测和计数了海洋中的浮游病毒，并且与透射电镜和荧光显微镜的计数结果基本一致。因此，在快速评估理化条件的改变对细菌数量的影响和消毒效果评价以及计算海洋湖泊藻类丰度等需要快速高效计数的研究中，应用流式细胞术显著优于传统的平板计数法[16-17]。

此外，FCM还具有独特的分选功能，它能够将其检测出来的细胞亚类群分选出来，供进一步深入研究，如利用流式细胞仪分选出来的细胞进行纯培养[18]，还可以结合分子生物学技术，进行系统进化分析[19]。甚至可以将单个细胞分选出来进行分析[20]，这必然也会成为一种新的研究趋势。

3.2 群落结构的分析

浮游微生物群落结构的研究一直是海洋生态学研究的重点，研究其群落结构、丰度和生物量的时空变化，不仅有助于学者探究浮游微生物与环境或生物因子之间的关系[21-23]，还可进一步了开发、利用和保护海洋资源[[24-25]。浮游病毒和异养细菌是生命与非生命系统之间联系的关键环节，是生源要素循环的重要驱动力[26]，浮游藻类也对水环境中物质循环和能量流动起着至关重要的作用[27]，若只采用人工检测方式对较大海域或者湖泊中浮游微生物的群落结构进行分析，工作量太大不易实现，FCM以其分析速度快、准确性高和灵敏度高等优势，在海洋浮游微生物群落结构分析中发挥着重要的作用，可通过仪器对浮游微生物进行快速计数和粗略分选，可大大缩短检测时间。纵观国内外相关领域的研究已经取得丰厚的成果，李中石等[28]应用FCM对马里亚纳海沟中浮游病毒的垂直分布和动态变化进行分析得出，病毒的生产力与温度成正相关，表明浮游病毒的活跃程度依赖于海水温度。沈丽新等[29]通过对三门湾微型浮游生物丰度时空变化的研究，得出温度是造成浮游微生物季节性差异的主要原因。Paerl等[30]通过对极端天气下水体中浮游植物的动态变化分析得出，降雨是影响河口浮游生物量激增的重要因素。同时，FCM在浮游微生物的食物网结构、昼夜变化节律、季节变化规律的研究分析中也发挥着出色的作用[31-32]，FCM的应用加快了学者对海洋微生物的群落结构和时空分布研究进展，也对了解海洋湖泊生态环境变化和物质循环具有重要意义。

3.3 水质安全的监测和预警

通过文献计量分析可以得出，FCM在饮用水和污水处理中的应用是当前国内外学者研究的热点，饮用水和再生水中微生物含量的测定是一项重要指标，直接反映水的细菌污染程度，对人体健康和水处理过程优化具有重大意义[33]。目前国际通用的检测饮用水中微生物的方法是平板计数法，但饮用水中的微生物仅有不到1%的细菌可以通过平板进行培养[34]，且只能对适应于特定培养基和培养环境的菌种进行检测[35]。而FCM因检测耗时少、操作简单、重复性好，并能克服微生物不可培养的阻碍等诸多优点，已逐渐应用于水质监测过程中[36]。Hammes等[37]应用FCM对瑞士饮用水进行了调查，揭示了常规饮用水处理工艺对细菌的去除规律，并检测出厂水细菌浓度约为9×104cells/mL。Jorien等[38]基于流式细胞仪检测图谱，计算了Bray-Curtis差异，并将其发展为明确的参数，以指示或警告操作事件中微生物饮用水质量的变化。所以，推荐该FCM检测方法作为饮用水厂微生物指标的测定方法。

此外，较高的有机物浓度可能会导致出厂水中未被消毒杀死的异养细菌重新生长，造成水体二次污染[39]，因此，实现对水中微生物的实时监测就显得尤为重要，Hammes等[40]建立了基于FCM的饮用水微生物总细菌浓度(TCC)的全自动在线监测系统，并已应用于自来水生产处理系统中。该在线监测系统可全自动实现包含抽样、试剂添加、稀释、恒温孵育等过程的水样前处理和FCM分析。Besmer等[41,42]利用FCM长时间高频率地自动在线监测水源地水和水务公司中处理水(絮凝—超滤—臭氧化—颗粒活性过滤)的微生物总细菌浓度含量变化，可以更好地理解和缓解微生物含量动态波动问题。自动化FCM在水质安全监测中的应用，能有效的避免一些重大水质安全问题的发生。

4 展望

近十年来，有关流式细胞仪的文献共计100 514篇文献，但在水环境中应用的文献只有745篇，仅占0.7%，且FCM在水环境中的应用范围也有限，基于目前研究现状，针对流式细胞仪的不足和改良进行总结。

(1)流式细胞仪在水环境中主要是对海洋湖泊中浮游微生物和饮用水中微生物的检测，由于微生物数量变化迅速，在实际工作中，需对部分样品进行现场检测，而目前大多数流式细胞仪包含液流系统、激光系统、计算机分析系统等大型设备，无法实现对样品的实时监测，因此便捷、自动化的仪器改进，将成为今后的研究方向，例如便携式浮游植物分析流式细胞仪、在线监测型流式细胞仪和水下流式细胞仪等，它们实现了对微型浮游生物进行连续定量、实时原位的监测[43-45]。随着科技的进一步发展，流式细胞仪将会越来越广泛地应用于水体微生物检测方面的研究。

(2)流式细胞仪在定量分析上可以做到便捷、高效、和精确等优点，但在定性分析中却有所欠缺，FCM分选出来的细胞类群大都并不是某特定的单一细胞群体，它们只是通过细胞光学性质区分出的具有相似性质(如大小、色素等)的某一生态功能群，其种群、类属信息还必需依靠显微观察和一定的经验才能确定。因此，可以将分选技术与成像技术相结合，被分选出的细胞可以清晰的呈现在计算机系统中，在通过数据库的对比，分析出细胞的种属，同时还可以和16sRNA测序结合，定性定量研究网管水中的致病菌，可为饮用水安全提供数据支撑。

(3)目前，流式细胞仪在水环境中的研究热点是在饮用水中的应用，但受限于微生物检测技术，《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)规定的微生物指标是基于HPC的检测结果，但HPC只能检测自来水中不到1%的微生物，因此，可用FCM作为对照工具，核验计数结果的准确性。

如上文所述，流式细胞仪在水环境微生物检测中具有重要的应用价值，但是，与其他技术一样，流式细胞仪也具有自身的障碍和局限。尽管如此，随着科学研究的进一步发展，并且结合其他辅助技术，流式细胞仪在水环境微生物学方面仍然具有很大的应用潜力和应用前景。此外，日本拟将核废水倾倒入海洋中，对于我国及周边国家的水质安全问题都带来了严峻的考验，水质安全的监测与预警的研究已将成为今后的一大研究热点，FCM作为水质检测类的新兴工具，也将得到更广泛的应用。