金黄色葡萄球菌肠毒素B的中和性全人源抗体制备①

刘成华 刘 玉 冯健男 沈倍奋 杨 光 （军事医学研究院毒物药物研究所，北京 100850）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，金葡菌）是造成人类食物中毒的常见致病菌之一，同时也是一种引起人和动物的局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及败血症、脓毒败血症等的重要致病菌［1］。肠毒素（Staphyloccucalenterotoxins，SEs）是由葡萄球菌分泌的细菌外毒素，目前已报道的有 SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG 等 20多种血清型，共称为葡萄球SE 超抗原，是细菌性食物中毒、化脓性感染、院内感染的重要毒素［2-9］。其中SEB 因其超抗原特性以及在中毒性休克综合征（SEB induced lethal shock，SEBILS）发病中的特殊意义而备受关注［10-11］。

SEB 是一种超抗原，极低剂量即可高效刺激哺乳动物及人的T 细胞增殖，并促使其释放多种细胞因子和产生细胞毒作用［12-13］。人体感染SEB 后，可引起呼吸困难、胸痛、严重者可造成发热、肺水肿、急性呼吸窘迫征、中毒性休克、多脏器的衰竭甚至死亡［14］。当前针对 SEB 诱导的 SEBILS 尚无非常有效的防治手段，静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIg）可缓解 SEB 诱导的炎性疾病的症状，但是IVIg 中特异性抗体含量低，副反应大并且有引起血源性病原体感染的危险［15］，多个研究小组已证实单克隆抗体对SEBILS 具有一定的中和保护作用［16-20］，但其保护功能并不理想，因此开发一种新型的高效的抗SEB抗体是目前SEB防治领域亟待解决的问题。

1 材料与方法

1.1 材料 金葡菌COL、大肠杆菌TG1、表达载体pET-28a（+）、pCDNA3.1、全人源 naive Fab 抗体库、M13KO7 为本实验室保存；细菌基因组DNA 提取试剂盒（赛百盛）；原核表达载体pMD-19T、限制性内切酶（NdeⅠ、XhoⅠ）（TaKaRa）；质粒提取、胶回收试剂 盒（Sango）；T4 DNA 连 接 酶 、DNA 聚 合 酶 、Trans2K plus DNA标志物、大肠杆菌感受态DH5α及BL21（DE3）（TransGen Biotech）；低相对分子质量蛋白标准（上海生化所）；Ni Sepharose 6 Fast Flow 纯化柱 、CNBr-activated SepharoseTM4B 亲 和 树 脂（GE Healthcare）；Anti-His（Mouse）单克隆抗体、Goat Anti-Mouse IgG/HRP（中杉金桥）；anti-M13 抗体（义翘神州）；PEG8000（Sigma）；其他试剂为国产分析纯；SPF级BALB/c纯系雌性实验小鼠（维通利华）。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a-SEB 重组质粒的构建 以金葡菌COL基因组为模板，PCR 扩增seb，PCR 条件如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，60 s；35个循环；72 ℃，10 min。扩增片段大小为720 bp；利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ将得到的seb基因片段双酶切后连接至pET-28a 载体，转化至E. coliBL21（DE3）感受态细胞中，经菌落PCR 及测序鉴定获得阳性克隆。

1.2.2 重组SEB 的诱导表达及纯化 挑取pET28a-SEB-BL21单克隆，接种至LB培养基（Kana+），37 ℃培养过夜；第 2 天转接，OD600nm=0.6 时加入IPTG（0.05 mmol/L），继续培养5 h，离心收集菌体；加入结合缓冲液（20 mmol/L Na3PO4，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH=7.4）重悬菌体，超声破碎，收集上清进行Ni2+柱纯化，收集洗脱液；洗脱液用PBS透析后进行SDS-PAGE检测。

1.2.3 SEBILS 模型检测重组 SEB 活性 8 周龄BALB/c 雌性小鼠24 只，随机分成3 组；腹腔注射致敏剂 D-GlaN 20 mg/只；30 min 后，腹腔注射重组SEB，72 h 内观察并记录小鼠的存活情况。

1.2.4 抗SEB 单克隆抗体的生物淘选 包被重组SEB 蛋白（10 μg/ml，500 μl）4 ℃过夜后，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h；加入噬菌体抗体库（噬菌体投入量约为 1.2×1012PFU），室温结合 1 h，PBS 洗涤 20 次后，加入 500 μl pH=2.2、0.1 mol/L 的 Gly-HCl 洗脱phage-Abs，收集洗脱液并用1.5 mol/L 的Tris-HCl（pH=8.8）中和至 pH=7.4；将 TG1 培养至 OD600nm=0.6 时，加入收集的洗脱液37 ℃感染30 min 后，4 000 r/min 离心15 min，菌体涂布于2YTAG平板上，37 ℃培养过夜；将过夜菌接种于2YTAG培养基中加入M13KO7辅助噬菌体进行噬菌体展示，采用PEG/NaCl沉淀，得到淘选后的噬菌体；3轮淘选后进行单克隆鉴定。

1.2.5 抗SEB 单克隆抗体阳性克隆的筛选 挑取淘选后的单克隆，接种于2YTAG 培养基中培养过夜，第2天转接至新鲜培养基培养至OD600nm=0.6，加入5×109PFU M13KO7，37 ℃感染30 min后离心收集沉淀，1 ml 2YTAK 重悬，28 ℃、220 r/min培养过夜后进行phage-ELISA 鉴定阳性克隆，并将阳性克隆进行测序。

1.2.6 抗SEB 全人源单克隆抗体的制备 将载体pCDNA3.1 的NdeⅠ和SalⅠ识别序列间的小片段分别替换为抗SEB 单克隆抗体VL、VHDNA 小片段，分别得到轻、重链表达载体。将构建好的轻、重链表达载体质粒共转染至293E细胞，进行全抗体分泌表达，经过Protein A 纯化，超滤浓缩后获得全抗体蛋白YG11-1、YG11-2。

1.2.7 SPR 测定YG11-1、YG11-2 的亲和力 芯片CM5偶联抗人Fc段抗体，将YG11-1、YG11-2分别稀释至 0.5 μg/ml，保证约 100 RU 抗体被抗人 Fc 的抗体捕获。将不同浓度SEB 重组蛋白流经固定相表面，分别测定YG11-1、YG11-2的亲和力。

1.2.8 YG11-1、YG11-2 与天然 SEB 结合活性检测 收集金葡菌COL培养上清，SDS-PAGE 电泳后电转至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭后，分别与YG11-1、YG11-2（1 μg/ml）4 ℃结合过夜，TBST 洗涤 4 次后加入 Goat Anti-Mouse IgG/HRP 室温孵育 30 min，TBST洗涤4 次后进行HRP-ECL 发光鉴定，利用X 胶片显影定影。

1.2.9 小鼠致死性休克模型检测YG11-1、YG11-2的中和活性 BALB/c 雌性小鼠40 只（鼠龄8 周）随机分成5组；腹腔注射致敏剂D-GlaN，20 mg/只；30 min后腹腔注射蛋白及抗体混合物样品，0.4 ml/只（其中重组SEB 20 μg），72 h内观察各组小鼠的死亡情况。

1.3 统计学处理 采用Graph Pad Prism 5.0 软件进行作图，Log-rank（Mantel-Cox）Test 分析不同数据间统计学差异。

2 结果

2.1 SEB 蛋白的重组表达 以COL基因组为模板扩增获得seb基因，琼脂糖凝胶电泳结果显示，约720 bp 处获得目的条带（图1A），继而将扩增产物酶切后克隆至pET-28a 载体。挑取pET-28a-SEB 阳性克隆，IPTG 诱导并超声处理，利用Ni2+柱纯化，最终获得重组SEB蛋白（图1B）。

图1 SEB蛋白的重组表达Fig.1 Preparation of recombinant SEB protein

2.2 SEBILS 模型检测重组SEB 活性 将小鼠随机分组后，腹腔注射致敏剂D-GlaN 及重组SEB 蛋白，观察各组小鼠72 h 内的死亡情况（图2）。如图所示，SEB的完全致死剂量为20 μg。

图2 SEBILS模型检测重组SEB活性Fig.2 Recombinant SEB activity was detected in mouse model of SEBILS

2.3 抗SEB 单克隆抗体的筛选 经过3 轮淘选后挑取所得的噬菌体单克隆进行ELISA 鉴定，并挑选阳性克隆送测序。结果显示，阳性率为89.8%（图3）。选取OD450nm值较高的10 个克隆送测序，获得2 组抗体序列，且两组抗体VH相同，分别命名为YG11-1、YG11-2。

图3 抗SEB单克隆抗体阳性克隆鉴定Fig.3 Detection of positive clones of anti-SEB

2.4 YG11-1、YG11-2 的 制 备 PCR 分 别 扩 增YG11-1、YG11-2 的 VH、VL片 段 ，并 将 其 连 接 至pCDNA3.1，分别得到轻、重链表达载体，将其共转染至293E 细胞后，进行全抗体分泌表达，经过Protein A纯化，PBS超滤后获得全抗体蛋白YG11-1、YG11-2（图 4）。

图4 YG11-1、YG11-2的制备Fig.4 Preparation of YG11-1 and YG11-2

2.5 YG11-1、YG11-2 的亲和力测定 利用表面等离子共振技术分别检测YG11-1、YG11-2 的亲和力。测定不同浓度的2 株全人源单克隆抗体（YG11-1，YG11-2）与抗原之间相互作用响应值，利用软件Biacore X100 Evaluation Software，version 2.0.1 对其相应曲线进行拟合，测得YG11-1、YG11-2 的亲和常数如表1所示。

表1 SPR测定YG11-1、YG11-2的亲和力Tab.1 SPR determinations of affinity of YG11-1 and YG11-2

2.6 YG11-1、YG11-2 与天然 SEB 蛋白结合活性检测 利用YG11-1、YG11-2 抗体检测金葡菌COL培养上清中天然的SEB 蛋白。结果显示YG11-1、YG11-2 抗体能够特异性识别COL培养上清中分泌的SEB蛋白（图5）。

图5 Western blot 检测 YG11-1、YG11-2 与天然 SEB 蛋白结合Fig.5 Binding activity of YG11-1 and YG11-2 to natural SEB protein was detected by Western blot

2.7 YG11-1、YG11-2对SEBILS小鼠的保护作用将小鼠随机分组后，对SEBILS模型小鼠分别腹腔注射不同剂量的YG11-1、YG11-2，观察并记录72 h 内各组小鼠的死亡情况。如图6 所示，YG11-1 200 μg组小鼠存活率有所提高，而YG11-2 200 μg 组小鼠存活率高达100%，表明YG11-2 可有效提高SEBILS模型中小鼠存活率。

图6 YG11-1、YG11-2对SEBILS小鼠的保护作用Fig.6 Protection of YG11-1 and YG11-2 in mouse model of SEBILS

3 讨论

本研究成功构建了pET-28a-SEB 重组表达载体，表达并纯化金葡菌重组蛋白SEB，并利用噬菌体抗体库筛选出具有较高亲和力的抗SEB 单克隆人源抗体YG11-1、YG11-2。进一步的研究结果表明，YG11-1、YG11-2 均能提高SEBILS 小鼠模型的存活率，并且YG11-2 能够达到100%保护率。本研究获得的两株全人源抗体具有相同的VH，但其中和活性具有显著差异，表明抗体的VL对其中和活性具有重要影响。

目前针对人体SEB 诱导的中毒性休克尚无有效的防治方法。静脉输注混合人体血清在一定程度上能缓解症状，但由于其来源的局限性和效果的不稳定性，它的应用受到很大限制［21-22］。已有研究表明单克隆抗体对SEBILS具有一定的保护作用，但也只能达到部分的保护效果，且Anti-SEB 多为鼠源单抗［12，23］。本研究利用噬菌体抗体库技术成功筛选并制备了对SEB 具有较高亲和力并且具有特异性中和作用的全人源单克隆抗体YG11-1、YG11-2，且YG11-2 可达到100%的保护效果，为SEB 的防治提供了新的选择。