血清IL-17A通过抑制DEL-1参与慢性乙型肝炎发病的机制研究

陈 诚 杨青青 陈邦涛 陈伟庆

（重庆大学附属肿瘤医院消化内科，教育部生物流变科学与技术重点实验室，重庆 400044）

全球约有2.4 亿人因感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）成为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者，而未经抗病毒治疗进展至肝硬化者占比达15%~40%，极大增加了肝癌与肝衰竭的发生率［1］；此外，因HBV 特殊的复制中间体共价闭合环状DNA（cccDNA）难以从肝细胞中被清除，CHB 目前仅能以血清乙肝表面抗原（HBsAg）持续阴转（即功能性治愈）为理想治疗终点，但即使经过1~5年的一线抗病毒治疗，仍仅有5%~13%的CHB 患者可获得 HBsAg 阴转［2-3］。故 HBV 慢性感染仍严重威胁着全球公共卫生。疫苗和阻断药在预防HBV 新发感染中已取得显著成绩，故抗HBV 治疗才是对WHO提出的2030年全面消灭CHB这一目标的最大挑战。为通过多元治疗以使更多CHB 患者达到功能性治愈，其关键是深层次理解HBV与宿主的互作关系。

有研究表明，T 细胞介导的适应性免疫应答通过分泌大量促炎或抑炎因子在HBV 逃逸宿主免疫监视中发挥重要作用［4-6］。其中，分泌重要促炎因子IL-17A 的 Th17 和 Tc17 细胞在 CHB 血循环和肝组织中均显著升高，且与肝组织损伤程度呈正相关［7-9］，但HBV 感染诱生的IL-17A 通过何种机制在复杂的微环境中促进HBV 引起肝损伤仍不明确。阐明CHB 患者IL-17A 上调的原因可为通过靶向抑制IL-17A 产生，减轻HBV 相关肝损伤提供证据支撑。IL-17A 表达与分泌受多因素调控，近年的部分研究提示，内皮细胞发育调节基因-1（developmental endothelial locus-1，DEL-1）可通过调节 IL-17A 稳态参与多种器官特异或系统性炎症性疾病［10］。分子量约52 kD 的DEL-1 又称为表皮生长因子样重复序列和盘状蛋白I 样结构域-3（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3，EDIL3），在肺、脑及骨组织等组成性地表达［10］，但其在肝脏中的表达及功能发挥尚不明确，尤其是无从考证DEL-1是否会通过与IL-17A的相互作用参与CHB 发病。本研究拟基于临床相关性分析和体外细胞实验初步探究IL-17A/DEL-1 通路在CHB 中的作用，以期能进一步加深对HBV致病机制的理解。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取2015 年至2016 年长治医学院附属和平医院CHB初治患者80例，同时从该院体检部选取年龄、性别及身体质量指数（BMI）与CHB 患者相匹配的健康志愿者40例为对照。CHB的诊断参照中国《慢性乙型肝炎防治指南》（2015 年版），同时排除：①正在或既往接受核苷酸类似物和/或干扰素治疗；②合并其他病毒性肝炎或人类免疫缺陷病毒感染或细菌感染性疾病；③合并酒精性或非酒精性脂肪肝病、药物性肝病或自身免疫性肝病等；④合并失代偿期肝硬化、肝癌或其他系统性疾病等；⑤近半年内系统地使用过糖皮质激素等免疫抑制剂或抗生素。所有入组对象在抽血前均签署书面知情同意书，本研究经过长治医学院附属和平医院伦理委员会审核批准。

1.1.2 主要试剂与细胞来源 人IL-17A ELISA kit（Elabscience，#E-EL-H5812c）；人 DEL-1 ELISA kit（R&D SYSTEMS，DY6046-05）；逆 转 录 试 剂 盒Quantscript RT Kit（天根生化，#KR103）；荧光定量试剂盒FastFire qPCR PreMix（天根生化，#FP207）；重组人IL-17A（Abcam，#ab9567）；重组人DEL-1（R&D SYSTEMS，#6046-ED）；DEL-1（ABclonal，#A15772）；IL-17A（ABclonal，#A0688）；β-actin（EASYBIO，#BE0037）；人外周血淋巴细胞分离液（索莱宝，#P8610）；人正常肝细胞（LO2）和人髓系白血病单核细胞（THP-1）均购自中科院细胞库；HepG2.2.15（稳定表达并分泌HBV 病毒颗粒）和HepG2 为本实验室保存；细胞培养用新生胎牛血清（FBS）及DMED培养基均购自Gibco。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集所有入组受者的年龄、性别、身高、体质量、肝功能指标、HBV 病毒学指标、HBV 感染病史、合并疾病、用药史等人口学及临床资料。

1.2.2 外周血标本处理 用抗凝管抽取患者空腹静脉血15 ml，其中3 ml 用于离心取血清，并冻存于-80 ℃待测血清中的DEL-1 及IL-17A 蛋白（根据各ELISA 试剂盒说明书操作，每份样品进行独立3 次检测后取均值）；采用Ficoll-Paque 梯度离心法从余下的12 ml全血中分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），其中1/3 PBMC立即加入1 ml Trizol溶解，2/3 PBMC加入1 ml含20%DMSO的细胞冻存液，均冻存于液氮中。PBMC 的提取在细胞超净台中操作，严格无菌。

1.2.3 细胞培养及刺激 HepG2.2.15、HepG2、THP-1、PBMC（源于对照组人群）及LO2 细胞均采用含10%FBS 及1%青链霉素的DMEM 培养于37 ℃、含 5%CO2的孵箱中。其中，THP-1、PBMC 及 LO2 细胞待培养至约80%融合度时，于培养基中加入等量HBV 病毒上清液（VS）联合重组人IL-17A 或重组人DEL-1处理24 h，重组蛋白剂量参考其他文献［11］。

1.2.4 荧光定量PCR（qPCR） 采用Trizol 法从全血分离的PBMC 或经培养处理的PBMC 中提取细胞总 RNA，取其中 1 μg 总 RNA 经 Quantscript RT Kit逆转为cDNA（总体积20 μl），稀释5倍后取2 μl cDNA经 FastFire qPCR PreMix 在 ABI 7500PCR 仪中荧光定量检测DEL-1、IL-17A和β-actin的mRNA水平，所用引物列于表1，程序为预变性95 ℃1 min 和40 个PCR 循环（95 ℃ 5 s+55 ℃ 10 s+72 ℃ 15 s），采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA的相对表达量。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.5 蛋白免疫印迹（Western blot） 采用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液从THP-1 和LO2 细胞中提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取30 μg 蛋白加入上样缓冲液，于10%SDS-PAGE 凝胶中进行恒压（80 V/120 V）电泳，而后于恒流（400 mA）条件下将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃过夜孵育，二抗室温孵育2 h，采用ECL 化学发光法检测靶蛋白。

1.3 统计学分析 所有原始数据编入Excel 表格，采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。连续性或二分类变量分别采用或率（%）表示，组间比较采用Studentt或卡方检验，相关性分析采用Pearson 线性相关分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象临床资料比较 如表2所示，与对照组相比，CHB 组在性别、年龄及BMI 等方面差异均无统计学意义（P＞0.05）；但 CHB 组肝炎（ALT、AST）、肝功能（TBiL 及白蛋白）及病毒学指标（HBVDNA、HBsAg 及HBeAg）与对照组相比差异有统计学意义。

表2 纳入研究对象基本资料Tab.2 Characteristics of subjects at baseline

2.2 血清DEL-1 与IL-17A 在CHB 患者中的相关性 如图 1A、B 所示，CHB 组血清 DEL-1 蛋白水平显 著 低 于 对 照 组［（33.82±12.80）vs（95.38±31.42）ng/ml，P＜0.001］，而 CHB 组血清 IL-17A 蛋白水平显著高于对照组［（71.21±21.23）vs（24.75±10.36）pg/ml，P＜0.001］；进一步相关性分析发现，CHB组血清DEL-1水平分别与血清IL-17A（r=-0.341，P=0.002，图 1C）和血清 ALT（r=-0.398，P＜0.001，图1D）呈显著负相关，与AST、TBiL、白蛋白、HBVDNA、HBsAg均无相关性（P＞0.05）。

图1 血清DEL-1与IL-17A蛋白含量分析Fig.1 Analysis of serum DEL-1 and IL-17A protein

2.3 DEL-1、IL-17A mRNA 在 PBMC 中 的 表达情况 qPCR 结果显示，CHB 组 IL-17A mRNA 相对表达水平是对照组的2.62±0.57 倍（P＜0.001，图2A），但DEL-1 mRNA 在2 组间差异无统计学意义；健康人PBMC经HBV上清液体外刺激后，PBMC中DEL-1 mRNA 仍无明显变化，而IL-17A mRNA 显著上升（P=0.016，图 2B）；外源性给予 DEL-1 处理后，IL-17A mRNA上升幅度随DEL-1浓度增加呈剂量依赖性减少（图2C）；为取得蛋白水平研究证据，进一步体外培养THP-1细胞（图2D），结果表明，经DEL-1处理或静息状态的THP-1 细胞均不表达IL-17A 蛋白，但VS 可刺激IL-17A 蛋白高表达，该上调作用可被外源活性DEL-1蛋白部分抑制，但各处理组THP-1细胞中DEL-1蛋白丰度均较低且无明显变化。这一结果提示CHB 患者血清IL-17A 升高至少部分源于HBV病毒成分对PBMC的刺激作用，且受血清DEL-1蛋白的调控。

图2 DEL-1和IL-17A在单核细胞中的表达分析Fig.2 Analysis of DEL-1 and IL-17A expressions in mononuclear cells

2.4 DEL-1 蛋白在肝细胞的表达情况 进一步体外培养LO2 细胞以探究CHB 患者血清DEL-1 下调与IL-17A 的关系（图3），结果表明，静息状态下LO2细胞具有较高丰度的DEL-1 蛋白表达水平，VS 刺激对DEL-1蛋白水平无明显影响；但无论是否有VS刺激，外源活性IL-17A 均可显著下调LO2 细胞中的DEL-1 蛋白水平；上述各处理组均未检测到IL-17A表达。提示CHB 患者血清DEL-1 下调可能与HBV病毒成分刺激PBMC分泌IL-17A有关。

图3 DEL-1和IL-17A在人正常肝细胞中表达分析Fig.3 Analysis of DEL-1 and IL-17A expressions in human normal liver cells

3 讨论

病毒与宿主相互作用的研究（尤其是对宿主抗病毒免疫应答规律的探索）是揭示病毒致病机制及开发抗病毒药物的永恒主题。无论是在发现HBV感染特异性受体（牛磺胆酸共转运多肽）的前后，宿主是否对HBV 感染具备固有免疫应答仍备受争议，其很大原因在于HBV 感染模型的异型性；而源于临床的大量证据一致证实，以淋巴细胞异常活化释放炎症介质为中心的适应性免疫应答是调控HBV 感染与致病的关键因素［6，12］。病毒复制和肝损伤是HBV 感染后的两个经典生物学事件，HBV 病毒成分诱发肝组织损伤与外周血或肝组织局部Th17 异常增多及活化密切相关［9，13］。LI 等［14］研究发现血清IL-17A水平在HBV 急性感染、CHB及免疫耐受期患者中均有显著差异，与此类似，本研究亦证实CHB患者较正常人具有更高的血清IL-17A 表达。另有研究进一步提示，HBV 可通过诱导趋化因子CCL17和 CCL22 表达来促进分泌 IL-17 的 T 细胞（Th17 和Tc17）进入肝组织加重肝损伤，而IL-17 还可经由IL-6/STAT3 通路促进HBV 所致的肝硬化进展为肝癌［8，15］。此外，临床上用于实现 CHB 功能性治愈的核苷酸类似物初始或序贯联合聚乙二醇干扰素也被证实能够抑制CHB 患者外周血PBMC 分泌IL-17蛋白［16-17］。这些证据不禁再度令人思考IL-17 在HBV感染致病中的贡献量和可能机制。

IL-17A 是IL-17 家族中最重要的一员，主要在CD4+Th17 细胞中表达，受上游IL-23 蛋白（由巨噬细胞及树突状细胞分泌）活性调控。但近年的研究发现，血清DEL-1 蛋白与多种IL-17A 升高的疾病（如牙周炎、败血症、过敏性哮喘及炎症性骨质疏松症等）均有关［10，18］。本研究发现 CHB 患者血清 DEL-1蛋白水平显著降低，且其表达水平与IL-17A 和ALT均呈负相关，此证据进一步支持DEL-1 与IL-17A 之间的联系。血清蛋白DEL-1主要由血管内皮细胞表达及分泌，其结构由N 端3 个表皮生长因子样结构域（E1-E3）和C 端2 个盘状结构域（C1-C2）构成；其中，E2 中 RGD 基序与炎症细胞表面 CD11a/CD18 结合介导其黏附并浸入血管内皮或其他组织细胞，从而诱发炎症［19］。但越来越多研究表明，其他多种细胞（如巨噬细胞及肿瘤细胞等）均可高表达DEL-1蛋白，且其在炎症发生至缓解的整个过程及恶性肿瘤进展中均有重要作用［20-23］。

本研究探索PBMC 是否为血清DEL-1 的重要来源，结果发现，DEL-1 mRNA 表达量在CHB 组与健康人组差异无统计学意义，体外采用VS 刺激正常PBMC 或THP-1 细胞亦不能显著改变其mRNA 或蛋白表达，且胞内蛋白丰度较低，这在一定程度上说明血清DEL-1 蛋白并非来自PBMC；相反，课题组却在LO2 细胞中检测到较高丰度的DEL-1 蛋白，但并不受VS影响，提示健康人群中高血清DEL-1水平可能部分来源于正常肝细胞，而HBV 能特异性感染肝细胞引起组织损伤释放ALT，进而可能破坏肝细胞稳态导致CHB 患者血清DEL-1 减少，这或许能解释血清中DEL-1与ALT呈负相关这一现象。但IL-17A是如何与抑炎蛋白DEL-1 相互关联从而调控CHB肝脏炎症反应的呢？本研究发现，重组DEL-1 蛋白可剂量依赖性地抑制PBMC 和THP-1 细胞中IL-17A mRNA 或蛋白表达，而重组IL-17A 蛋白亦可抑制LO2细胞中DEL-1蛋白含量，这与临床标本中DEL-1与IL-17A呈负相关的结论一致。DEL-1抑制IL-17A的具体机制目前仍不清楚，但比较明确的是，IL-17A可通过激活糖原合酶激酶3β（GSK3β）进而抑制DEL-1 上游转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）的转录活性来下调 DEL-1 的蛋白表达［10，24］。综上，推测DEL-1 是肝细胞维持稳态的一种抑炎因子，但在 CHB 患者中，HBV 可刺激 PBMC 分泌大量的IL-17A，进而下调肝细胞DEL-1蛋白水平，从而产生肝炎症状。

本研究存在如下不足：首先，DEL-1与IL-17A的关系是否在HBV 感染后的不同临床病程（如急性肝炎、免疫耐受期、有效抗病毒治疗前后）中均存在尚不明确；其次，CHB 患者血清DEL-1 的改变是源于肝细胞损伤的证据并不充分，尚不能排除源于血管内皮细胞功能改变的可能；第三，未评估血清IL-17A和DEL-1蛋白对HBV复制的影响，也未探究HBV各病毒成分对此2种血清蛋白的直接作用。欲进一步解决以上问题，可纳入多类型HBV 感染的临床病例，开展HBV 感染原代肝细胞和实验动物等相关研究。

总之，本研究证实了血清IL-17A 与DEL-1 在CHB 患者中的关系，并初步表明血清IL-17A 可通过抑制肝细胞DEL-1 表达促进HBV 感染引发肝脏炎症，这进一步丰富了对T 淋巴细胞介导的适应性免疫应答在HBV 慢性感染引发肝组织损伤作用的理解。